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SOLiD (Sequencing by Oligonutrote Ligation and Detection) は、Life Technologiesが開発した次世代 DNA シーケンシング技術で、2006 年から市販されています。この次世代技術は、一度に10 8 - 10 9 個の小さなシーケンス リードを生成します。2塩基エンコーディングを使用して、シーケンシング プラットフォームによって生成された生データをシーケンス データにデコードします。
この方法は、ロッシュ 454ピロシーケンシング(2005 年に導入され、2009 年に 200～400bp の読み取りを数百万回生成) やソレクサシステム (現在はイルミナが所有) (2006 年に導入され、2009 年に 50～100bp の読み取りを数億回生成) で使用される原理である「合成によるシーケンシング」 と混同しないでください。
これらの方法により、コストは 2004 年の 1 塩基あたり 0.01 ドルから 2006 年には約 0.0001 ドルにまで削減され、シーケンシング能力は 2004 年の 1 日あたり 100 万塩基/マシンから 2009 年には 1 日あたり 50 億塩基/マシン以上に増加しました。Valouev らによるヌクレオソームの位置決め、Cloonanらによる転写プロファイリングまたはストランド感受性 RNA-Seq、Tang らによる単一細胞転写プロファイリング、そしてMcKernan らによるヒトの再シーケンシング[ 4 ]など、30 を超える出版物でその使用が説明されています。
この機械が使用する方法（ライゲーションによるシーケンシング）では、回文配列のシーケンシングに問題があることが報告されている。[5]
化学
配列決定するサンプルから DNA フラグメントのライブラリが作成され、クローン ビーズ集団の作成に使用されます。つまり、各磁気ビーズの表面には 1 種類のフラグメントのみが存在することになります。磁気ビーズに付着したフラグメントにはユニバーサル P1 アダプター シーケンスが付着しているため、すべてのフラグメントの開始シーケンスは既知であり、同一です。エマルジョンPCR は、 PCR に必要なすべての試薬を含むマイクロリアクターで行われます。結果として得られた PCR 産物を含むビーズは、ガラス スライドに置かれます。
プライマーは、ライブラリ テンプレート内の P1 アダプター シーケンスにハイブリダイズします。蛍光ラベルされた 4 つの 2 塩基プローブのセットは、シーケンシング プライマーへのライゲーションを競います。2 塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応で 1 番目と 2 番目の塩基をすべて調べることで実現されます。ライゲーション、検出、および切断の複数のサイクルが実行され、サイクル数によって最終的な読み取り長が決まります。一連のライゲーション サイクルの後、伸長産物が除去され、2 回目のライゲーション サイクルのために n-1 位置に相補的なプライマーでテンプレートがリセットされます。
各シーケンス タグに対して 5 ラウンドのプライマー リセットが完了します。プライマー リセット プロセスを通じて、各塩基は 2 つの異なるプライマーによる 2 つの独立したライゲーション反応で調べられます。たとえば、読み取り位置 5 の塩基は、ライゲーション サイクル 2 ではプライマー番号 2 によって、ライゲーション サイクル 1 ではプライマー番号 3 によって分析されます。
スループットと精度
ABI によると、SOLiD 3plus プラットフォームは、1 回の実行で 60 ギガベースの使用可能な DNA データを生成します。2 塩基エンコード システムのため、固有の精度チェックがテクノロジーに組み込まれており、99.94% の精度を提供します。システムの化学的性質により、Roche 454 FLX システムとは異なり、ホモポリマーによって妨げられることがなく、そのため、大きくて難しいホモポリマー繰り返し領域を配列することが問題ではなくなりました。
アプリケーション
当然、この技術は DNA の配列解析に使用されますが、すべての次世代技術は高度な並列性を備えているため、トランスクリプトミクスやエピゲノミクスにも応用できます。
マイクロアレイは、過去 10 年間トランスクリプトミクスの主流でしたが、その後アレイ ベースのテクノロジーは他の分野にも広がりました。ただし、チップ上にあるプローブの情報しか取得できないという制限があります。チップが利用できる生物の情報しか取得できず、多数の分子をハイブリダイズする (ハイブリダイズ温度が異なる) という問題も伴います。次世代シーケンシングによる RNA-Seq トランスクリプトミクスでは、これらの障壁はもはや当てはまりません。あらゆる生物のトランスクリプトーム全体を 1 回の実行でシーケンシングできる可能性があり (非常に小さな細菌ゲノムの場合)、各トランスクリプトの識別が可能になるだけでなく、定量的な読み取りも達成できるため、発現プロファイリングも可能になります。
クロマチン免疫沈降法(ChIP) は、転写因子の結合部位と DNA とタンパク質の相互作用を決定する方法です。過去にはアレイ技術 (ChIP-チップ) と組み合わせて、ある程度の成功を収めてきました。この分野では次世代シーケンシングも適用できます。メチル化免疫沈降法 (MeDIP) もアレイ上で実行できます。
ゲノム規模でメチル化と TF 結合部位についてさらに詳しく知る能力は貴重なリソースであり、病気や分子生物学全般について多くのことを教えてくれるかもしれません。
参照
参考文献
- ^ Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T, et al. (2008年7月). 「C. elegansの高解像度ヌクレオソーム位置マップは、普遍的な配列決定による配置の欠如を明らかにする」.ゲノム研究. 18 (7): 1051–63. doi :10.1101/gr.076463.108. PMC 2493394. PMID 18477713.
- ^ Cloonan N 、 Forrest AR、Kolle G 、他 (2008 年 7 月)。「大規模 mRNA シーケンシングによる幹細胞トランスクリプトームプロファイリング」。Nature Methods。5 ( 7 ): 613–9。doi :10.1038/nmeth.1223。PMID 18516046。S2CID 19790151。
- ^ Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. (2009年5月). 「単一細胞のmRNA-Seq全トランスクリプトーム解析」. Nature Methods . 6 (5): 377–82. doi :10.1038/nmeth.1315. PMID 19349980. S2CID 16570747.
- ^ McKernan KJ、Peckham HE、Costa GL、他 (2009 年 9 月)。「2 塩基エンコーディングを使用したショートリード、大規模並列ライゲーション シーケンシングによって明らかにされたヒトゲノムの配列と構造変異」。ゲノム研究 。19 ( 9 ) : 1527–41。doi :10.1101/gr.091868.109。PMC 2752135。PMID 19546169。
- ^ Yu-Feng Huang、Sheng-Chung Chen、Yih-Shien Chiang、Tzu-Han Chen (2012)。「回文配列はライゲーションによるシーケンシング機構を妨げる」。BMC Systems Biology。6 ( Suppl 2 ): S10。doi : 10.1186/ 1752-0509-6 -S2- S10。PMC 3521181。PMID 23281822 。
さらに読む
- Mardis ER (2008)。 「次世代 DNA シーケンシング法」。ゲノム科学と人類遺伝学の年次レビュー。9 : 387–402。doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164359。PMID 18576944 。
- Mardis ER (2009). 「大規模並列シーケンシング のための新しい戦略と新興技術：医療研究への応用」。ゲノム医学。1 ( 4): 40. doi : 10.1186/ gm40。PMC 2684661。PMID 19435481。