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DNAナノボールシーケンシング（DNBSEQ）は、生物のゲノム配列全体を決定するために使用されるハイスループットシーケンシング技術です。この方法は、ローリングサークル複製を使用して、ゲノムDNAの小さな断片をDNAナノボールに増幅します。蛍光ヌクレオチドは相補的なヌクレオチドに結合し、その後重合して、DNAテンプレート上の既知の配列に結合した配列を固定します。塩基の順序は、結合したヌクレオチドの蛍光によって決定されます[ 2 ]。このDNAシーケンシング法では、他の次世代シーケンシングプラットフォームと比較して、 1回のランで多数のDNAナノボールをシーケンスすることができ、試薬コストが低くなります[ 3 ] 。 ただし、この方法の制限は、短いDNA配列しか生成されないため、そのリードをリファレンスゲノムにマッピングすることが困難であることです[ 2 ]。北京ゲノム研究所（BGI）は、 Complete Genomicsを購入した後、独自のプラットフォームでヌクレオチドサンプルをシーケンスするためにDNAナノボールシーケンシングを改良しました[ 4 ] [ 5 ] 。
DNAナノボールシーケンシングでは、シーケンシング対象のDNAを単離し、それを100～350塩基対（bp）の小さな断片に切断し、アダプター配列を断片に連結し、断片を環状化します。環状断片はローリングサークル複製によって複製され、各断片の多数の一本鎖コピーが生成されます。DNAコピーは長い鎖で頭尾に連結され、DNAナノボールに圧縮されます。ナノボールはシーケンシングフローセルに吸着されます。各検査位置の蛍光の色は高解像度カメラで記録されます。 バイオインフォマティクスは、蛍光データを解析して塩基コールを行い、50bp、100bp、または150bpのシングルエンドまたはペアエンドリードをマッピングまたは定量化するために使用されます。[ 6 ] [ 2 ]
細胞を溶解し、細胞溶解液からDNAを抽出します。高分子量DNA（多くの場合、数メガ塩基対の長さ）は、物理的または酵素的方法によってDNA二本鎖をランダムな間隔で切断することにより断片化されます。シーケンスリードのバイオインフォマティクスマッピングは、サンプルDNAが狭い長さ範囲を含む場合に最も効率的です。[ 7 ]小さなRNAシーケンスの場合、シーケンスに最適な断片長の選択はゲル電気泳動によって行われます。[ 8 ]より大きな断片のシーケンスの場合、DNA断片はビーズベースのサイズ選択によって分離されます。[ 9 ]
アダプターDNA配列は、未知のDNA断片に付加され、既知の配列を持つDNAセグメントが未知のDNAを挟むようにする必要があります。アダプターライゲーションの最初のラウンドでは、右（Ad153_right）および左（Ad153_left）アダプターが断片化されたDNAの右側と左側に付加され、DNAはPCRによって増幅されます。次に、スプリントオリゴが断片の末端にハイブリダイズし、環状に連結されます。エキソヌクレアーゼが添加され、残っているすべての線状一本鎖および二本鎖DNA産物が除去されます。結果として、完成した環状DNAテンプレートが得られます。[ 2 ]
2 つの固有のアダプター配列に連結されたサンプル DNA を含む一本鎖環状 DNA テンプレートが作成されると、完全な配列が長い DNA 鎖に増幅されます。これは、 DNA テンプレートに結合して複製するPhi 29 DNA ポリメラーゼによるローリング サークル複製によって行われます。新しく合成された鎖は環状テンプレートから放出され、環状テンプレートの複数のヘッド トゥ テール コピーからなる長い一本鎖 DNA が生成されます。[ 10 ]結果として得られるナノ粒子は、直径約 300ナノメートル(nm)の密な DNA ボールに自己集合します。ナノボールは負に帯電しているため自然に反発し合い、異なる長さの一本鎖 DNA 間の絡まりが軽減されるため、互いに分離した状態を保ちます。[ 2 ]
DNA配列を取得するために、DNAナノボールはパターン化されたアレイフローセルに取り付けられます。フローセルは、二酸化ケイ素、チタン、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）、およびフォトレジスト材料でコーティングされたシリコンウェハです。DNAナノボールはフローセルに追加され、高度に秩序だったパターンで正に帯電したアミノシランに選択的に結合し、非常に高密度のDNAナノボールの配列決定が可能になります。[ 2 ] [ 11 ]
各DNAヌクレオチドの組み込みステップの後、フローセルを画像化して、どのヌクレオチド塩基がDNAナノボールに結合したかを決定します。蛍光色素は、特定の波長の光を励起するレーザーで励起されます。各DNAナノボールからの蛍光の放出は、高解像度CCDカメラで捉えられます。その後、画像は処理され、背景ノイズが除去され、各点の強度が評価されます。各DNAナノボールの色は、質問位置の塩基に対応しており、コンピュータが塩基の位置情報を記録します。[ 2 ]
DNAナノボールから生成されるデータは、連続した塩基（ギャップなし）を含む標準的なFASTQ形式のファイルとしてフォーマットされます。これらのファイルは、シングルエンドまたはペアエンドのFASTQファイルを読み取るように構成されたあらゆるデータ解析パイプラインで使用できます。
例えば：
@CL100011513L1C001R013_126365/1 CTAGGCAACTATAGGTCTCAGTTAAGTCAAATAAAATTCACATCAAATTTTTACTCCCACCATCCCAACACTTTCCTGCCTGGCATATGCCGTGTCTGCC + FFFFFFFFFFFGFGFFFFFF;FFFFFFFGFGFGFFFFFF;FFFFGFGFGFFEFFFFFEDGFDFF@FCFGFGCFFFFFEFFEGDFDFFFFFGDAFFEFGFF
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@CL100011513L1C001R013_126365/2 TGTCTACCATATTCTACATTCCACACTCGGTGAGGGAAGGTAGGCACATAAAGCAATGGCAGTACGGTGTAATACATGCTAATGTAGAGTAAGCACTCAG + 3E9E<ADEBB:D>E?FD<<@EFE>>ECEF5CE:B6E:CEE?6B>B+@??31/FD:0?@:E9<3FE2/A:/8>9CB&=E<7:-+>;29:7+/5D9)?5F/:
一般的なアライナーのデフォルトパラメータで十分です。
BGI/MGIシーケンサーがパターンアレイフローセル上でDNAナノボールを使用して作成したFASTQファイルでは、リード名は次のようになります。
BGISEQ-500: CL100025298L1C002R050_244547
MGISEQ-2000: V100006430L1C001R018613883
リード名を解析することで、パターンアレイ上のリードの物理的な位置を示す3つの変数（(1)タイル/領域、(2)x座標、(3)y座標）を抽出できます。これらの変数の順序の関係上、Picard MarkDuplicatesではこれらのリード名をそのまま解析して光学的重複を識別することはできません。ただし、このプラットフォームには光学的重複が存在しないため、Picardベースのデータ解析には問題ありません。
DNAナノボールはパターン化されたアレイ上のそれぞれの位置に留まるため、シーケンスリードのバイオインフォマティクス解析中に光学的な重複に対処する必要はありません。Picard MarkDuplicatesは次のように実行することをお勧めします。
java -jar picard.jar MarkDuplicates I=input.bam O=marked_duplicates.bam M=marked_dup_metrics.txt READ_NAME_REGEX=null
Picardに対応した、再フォーマットされたリード名を用いたテストでは、この種の重複リードは存在しないことが実証された。
光学的重複としてマークされた単一のリードは、間違いなくアーティファクトである。いずれにせよ、推定ライブラリサイズへの影響はごくわずかである。
DNAナノボールシーケンシング技術は、他のシーケンシングプラットフォームに比べていくつかの利点がある。その一つは、光学的重複を排除できる点である。DNAナノボールはパターン化されたアレイ上に留まり、隣接するナノボールと干渉しない。
DNAナノボールシーケンシングのもう1つの利点としては、高忠実度Phi 29 DNAポリメラーゼ[ 10 ]を使用して環状テンプレートの正確な増幅を保証すること、数百コピーの環状テンプレートが小さな領域に圧縮されて強いシグナルが得られること、および蛍光色素がライゲーションポイントから遠く離れたプローブに結合してライゲーションが改善されることが挙げられる。[ 2 ]
DNAナノボールシーケンスの主な欠点は、この方法で得られるDNA配列のリード長が短いことです。[ 2 ]短いリード、特にDNA反復配列が多いDNAの場合、参照ゲノムの2つ以上の領域にマッピングされる可能性があります。この方法の2つ目の欠点は、PCRを複数回行う必要があることです。これによりPCRバイアスが生じ、テンプレート構築段階で汚染物質が増幅される可能性があります。[ 2 ]ただし、これらの欠点はすべてのショートリードシーケンスプラットフォームに共通するものであり、DNAナノボールに特有のものではありません。
DNAナノボールシーケンシングは最近の研究で使用されています。Leeらはこの技術を使用して肺がんに存在する変異を見つけ、正常な肺組織と比較しました。[ 13 ]彼らは50,000を超える一塩基変異を特定することができました。RoachらはDNAナノボールシーケンシングを使用して4人の親族のゲノムをシーケンスし、メンデル遺伝性疾患の原因となる可能性のあるSNPを特定し、[ 14 ]世代間の突然変異率を推定することができました。[ 14 ]システム生物学研究所はこの技術を使用して、神経変性疾患を研究する調査の一環として615の完全なヒトゲノムサンプルをシーケンスし、国立がん研究所はDNAナノボールシーケンシングを使用して、小児がんの50の腫瘍と対応する正常組織をシーケンスしています。
DNAナノボールシーケンシングのような大規模並列次世代シーケンシングプラットフォームは、多くの遺伝性疾患の診断と治療に貢献する可能性がある。DNAナノボール技術により、ヒトゲノム全体のシーケンシング費用は2008年の約100万ドルから2010年には4400ドルにまで下がった。[ 15 ]遺伝性疾患や癌患者のゲノム全体をシーケンシングすることで、これらの疾患に関連する変異が特定され、リスクのある人に対する標的治療や遺伝カウンセリングなどの戦略が開かれた。[ 15 ] ヒトゲノム全体のシーケンシング費用が1000ドルに近づくにつれて、通常の予防医学の一環として、すべての個人のゲノムシーケンシングが実現可能になるかもしれない。[ 15 ]