DNAマイクロアレイ

マイクロアレイは、検査対象となるプローブの数、コスト、カスタマイズ要件、および研究課題の種類に応じて、さまざまな方法で製造できます。市販のマイクロアレイには、10個のプローブしかないものから、500万個以上のマイクロメートルスケールのプローブを持つものまであります。

マイクロアレイは、ガラススライド上に細いピンで印刷する、既製のマスクを使用したフォトリソグラフィー、動的マイクロミラーデバイスを使用したフォトリソグラフィー、インクジェット印刷^{[ 11 ] [ 12 ]} 、またはマイクロ電極アレイ上の電気化学など、さまざまな技術を使用して製造できます。

スポット型マイクロアレイでは、プローブはオリゴヌクレオチド、cDNA 、またはmRNAに対応するPCR産物の小さな断片です。プローブはアレイ表面への塗布前に合成され、その後ガラス上に「スポット」されます。一般的な手法では、ロボットアームで制御される細いピンまたは針のアレイを使用し、DNAプローブを含むウェルに浸漬した後、各プローブをアレイ表面の指定された場所に塗布します。こうしてできたプローブの「グリッド」は、調製されたプローブの核酸プロファイルを表し、実験サンプルまたは臨床サンプル由来の相補的なcDNAまたはcRNA「ターゲット」を受け入れる準備が整います。この技術は、世界中の研究者が自身の研究室で「社内」印刷マイクロアレイを作成するために使用しています。研究者はプローブとアレイ上の印刷位置を選択し、自身の研究室（または共同研究施設）でプローブを合成し、アレイにスポットできるため、これらのアレイは各実験に合わせて容易にカスタマイズできます。その後、ハイブリダイゼーション用の独自のラベル付きサンプルを作成し、サンプルをアレイにハイブリダイズさせ、最後に独自の機器でアレイをスキャンすることができます。これにより、各研究に合わせてカスタマイズできる比較的低コストのマイクロアレイが実現し、研究者にとって関心のない膨大な数の遺伝子を表す可能性のある、より高価な市販のアレイを購入するコストを回避できます。社内でスポットしたマイクロアレイは、市販のオリゴヌクレオチドアレイと比較して同じレベルの感度を提供しない可能性があることを示す出版物があります^{[ 13 ]} 。これは、オリゴアレイの工業的製造と比較して、バッチサイズが小さく、印刷効率が低下しているためと考えられます。

オリゴヌクレオチドマイクロアレイでは、プローブは既知または予測されるオープンリーディングフレームの配列の一部に一致するように設計された短い配列です。オリゴヌクレオチドプローブは「スポット型」マイクロアレイでよく使用されますが、「オリゴヌクレオチドアレイ」という用語は、ほとんどの場合、特定の製造技術を指します。オリゴヌクレオチドアレイは、完全な配列を堆積させる代わりに、単一の遺伝子または遺伝子スプライスバリアントファミリーを表すように設計された短いオリゴヌクレオチド配列をアレイ表面に直接合成することによって作成されます。配列は、目的に応じて、より長いもの（ Agilent設計などの60merプローブ）またはより短いもの（ Affymetrixが製造する25merプローブ）があります。長いプローブは個々の標的遺伝子に対してより特異的であり、短いプローブはアレイ全体に高密度でスポットでき、製造コストも安価です。オリゴヌクレオチドアレイを作製するために使用される技術の 1 つは、シリカ基板上で光と感光性マスキング剤を使用してアレイ全体にわたって一度に 1 つのヌクレオチドずつ配列を「構築」するフォトリソグラフィー合成 (Affymetrix) です。[ ^{14 ]各}適用可能なプローブは、アレイを単一のヌクレオチドの溶液に浸す前に選択的に「マスク解除」され、その後マスキング反応が起こり、次のプローブのセットがマスク解除されて、異なるヌクレオチドの露光に備えます。これを何度も繰り返すと、すべてのプローブの配列が完全に構築されます。最近では、NimbleGen Systems の Maskless Array Synthesis が柔軟性と多数のプローブを組み合わせています。^{[ 15 ]}

2色マイクロアレイまたは2チャンネルマイクロアレイは、通常、比較する2つのサンプル（例えば、病変組織と健常組織）から調製され、2種類の異なる蛍光色素で標識されたcDNAとハイブリダイズされます。[ 16 ^{] cDNA標識} に一般的に使用される蛍光色素には、蛍光発光波長が570 nm（光スペクトルの緑色部分に対応）のCy 3と、蛍光発光波長が670 nm（光スペクトルの赤色部分に対応）のCy 5があります。2つのCy標識cDNAサンプルを混合し、1つのマイクロアレイにハイブリダイズした後、マイクロアレイ スキャナでスキャンして、定義された波長のレーザービームで励起した後の2つの蛍光色素の蛍光を可視化します。各蛍光色素の相対強度は、比率ベースの分析で使用して、アップレギュレーションされた遺伝子とダウンレギュレーションされた遺伝子を特定することができます。^{[ 17 ]}  

オリゴヌクレオチドマイクロアレイには、RNAスパイクインとハイブリダイズするように設計されたコントロールプローブが搭載されていることが多い。スパイクインとコントロールプローブ間のハイブリダイゼーションの程度は、ターゲットプローブのハイブリダイゼーション測定値を正規化するために使用される。2色アレイではまれに遺伝子発現の絶対レベルを測定できる場合もあるが、2色システムでは、サンプル内の異なるスポット間およびサンプル間の発現の相対的な差を測定することがデータ解析の好ましい方法である。このようなマイクロアレイを提供する企業の例としては、AgilentのDual-Modeプラットフォーム、EppendorfのDualChipプラットフォーム（比色法によるSilverquant標識用）、TeleChem InternationalのArrayitなどが挙げられる。

シングルチャンネルマイクロアレイまたは単色マイクロアレイでは、アレイは各プローブまたはプローブセットの強度データを提供し、標識されたターゲットとの相対的なハイブリダイゼーションレベルを示します。ただし、これらは遺伝子の真の存在量レベルを示すのではなく、同じ実験で処理された他のサンプルまたは条件と比較した場合の相対的な存在量を示します。各RNA分子は、実験の増幅、標識、およびハイブリダイゼーションの各段階でプロトコルおよびバッチ固有のバイアスを受けるため、同じマイクロアレイの遺伝子間の比較は有益ではありません。同じ遺伝子の2つの条件を比較するには、2つの別々の単一色素ハイブリダイゼーションが必要です。一般的なシングルチャンネルシステムには、Affymetrixの「Gene Chip」、Illuminaの「Bead Chip」、Agilentのシングルチャンネルアレイ、Applied Microarraysの「CodeLink」アレイ、およびEppendorfの「DualChip & Silverquant」などがあります。単一色素システムの強みの一つは、異常なサンプルが他のサンプルから得られる生データに影響を与えない点です。これは、各アレイチップが単一のサンプルにしか曝露されないためです（一方、2色システムでは、たとえ他のサンプルが高品質であっても、単一の低品質サンプルが全体のデータ精度に著しく影響を与える可能性があります）。もう一つの利点は、バッチ効果が考慮されていれば、異なる実験のアレイ間でのデータ比較が容易になることです。

状況によっては、1チャンネルマイクロアレイが唯一の選択肢となる場合もある。${\displaystyle i}$サンプルを比較する必要がある場合、サンプルを基準として使用しない限り、2つのチャネルアレイを使用した実験の数はすぐに非現実的なものになります。

これは、 DNAマイクロアレイ実験の具体例であり、特定のケースの詳細を含めることでDNAマイクロアレイ実験をより分かりやすく説明するとともに、RNA実験やその他の代替実験における変更点も記載しています。

1. 比較対象となる2つのサンプル（ペアワイズ比較）は、培養または採取されたものです。この例では、処理済みサンプル（ケース）と未処理サンプル（コントロール）です。
2. 目的の核酸を精製します。これは、発現プロファイリング用のRNA、比較ハイブリダイゼーション用のDNA、またはエピジェネティクスや制御研究のために免疫沈降（ChIP-on-chip）された特定のタンパク質に結合したDNA/RNAです。この例では、グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出（例：Trizol ）により、全RNA（核RNAと細胞質RNAの両方）を分離します。この方法ではほとんどのRNAが分離されます（カラム法では200ヌクレオチドのカットオフがあります）。また、正しく行えば、より高い純度が得られます。
3. 精製されたRNAは、品質（キャピラリー電気泳動法）と量（例えば、NanoDropまたはNanoPhotometer分光光度計を使用）について分析されます。材料の品質が許容範囲内であり、十分な量（例えば、 1μg以上。ただし、必要な量はマイクロアレイプラットフォームによって異なります）が存在する場合、実験を進めることができます。
4. 標識された産物は逆転写によって生成され、その後、必要に応じてPCR増幅が行われます。RNAは、ポリTプライマー（ mRNAのみを増幅）またはランダムプライマー（すべてのRNAを増幅し、その大部分はrRNA）のいずれかを使用して逆転写されます。miRNAマイクロアレイは、精製された小型RNA（フラクショネーターで分離）にオリゴヌクレオチドを連結し、その後、逆転写および増幅します。
   • 標識は、逆転写ステップ中、または増幅が行われた場合は増幅後に付加されます。センス標識はマイクロアレイに依存します。例えば、RTミックスで標識が付加される場合、ネガティブコントロールの場合を除き、 cDNAはアンチセンス、マイクロアレイプローブはセンスとなります。
   • 標識は通常蛍光性であり、放射性標識を使用する機械は1台のみである。
   • 標識は直接（使用しない）または間接（カップリング段階が必要）のいずれかです。2 チャンネルアレイの場合、カップリング段階はハイブリダイゼーションの前にアミノアリルウリジン三リン酸（アミノアリル-UTP、または aaUTP）とNHSアミノ反応性色素（シアニン色素など）を使用して行われます。シングルチャンネルアレイの場合、カップリング段階はハイブリダイゼーションの後にビオチンと標識ストレプトアビジンを使用して行われます。修飾ヌクレオチド（通常は aaUTP 1：TTP（チミジン三リン酸） 4 の比率）は、通常のヌクレオチドに対して低比率で酵素的に添加され、通常は 60 塩基ごとに 1 個になります。次に、aaDNA はカラムで精製されます（トリスにはアミン基が含まれているため、リン酸緩衝液を使用します）。アミノアリル基は、核酸塩基に結合した長いリンカー上のアミン基であり、反応性色素と反応します。
     • 2チャンネル実験における色素アーチファクトを制御するために、色素反転と呼ばれる複製実験を行うことができます。色素反転では、2枚目のスライドを使用し、ラベルを交換します（1枚目のスライドでCy3で標識されたサンプルをCy5で標識し、その逆も同様です）。この例では、アミノアリル-UTPが逆転写混合物中に存在します。
5. 標識されたサンプルは、 SDS、SSC、デキストラン硫酸、ブロッキング剤（Cot-1 DNA、サケ精子DNA、仔牛胸腺DNA、PolyA、PolyTなど）、デンハルト溶液、またはホルムアミンからなる独自のハイブリダイゼーション溶液と混合されます。
6. 混合物を変性させ、マイクロアレイのピンホールに注入する。ピンホールを密閉し、マイクロアレイをハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイを回転させて混合するハイブリダイゼーションオーブン、またはピンホールに交互に圧力を加えることで混合するミキサーのいずれかで行う。
7. 一晩ハイブリダイゼーションを行った後、非特異的結合をすべて洗い流します（SDSおよびSSC）。
8. マイクロアレイは乾燥後、レーザーを用いて色素を励起し、検出器で発光レベルを測定する装置によってスキャンされる。
9. 画像はテンプレートを用いてグリッド化され、各特徴（複数のピクセルから構成される）の強度が定量化される。
10. 生データは正規化されます。最も単純な正規化方法は、バックグラウンド強度を減算し、2つのチャネルの特徴の総強度が等しくなるようにスケーリングするか、参照遺伝子の強度を使用してすべての強度のt値を計算することです。より高度な方法としては、z比、loessおよびlowess回帰、 Affymetrixチップ（シングルチャネル、シリコンチップ、in situ合成ショートオリゴヌクレオチド）用のRMA（ロバストマルチチップ解析）などがあります。

遺伝子発現の生物学的複雑さゆえに、発現プロファイリングに関する記事で議論されている実験デザインに関する考慮事項は、データから統計的にも生物学的にも妥当な結論を導き出すためには極めて重要である。

マイクロアレイ実験を設計する際には、主に3つの要素を考慮する必要があります。まず、実験から結論を導き出すためには、生物学的サンプルの複製が不可欠です。次に、技術的複製（例えば、各実験ユニットから得られた2つのRNAサンプル）は、精度を定量化するのに役立つ場合があります。生物学的複製には、独立したRNA抽出が含まれます。技術的複製は、同じ抽出液の2つのアリコートである場合があります。3つ目に、各cDNAクローンまたはオリゴヌクレオチドのスポットは、マイクロアレイのスライド上に複製（少なくとも2つ）として存在し、各ハイブリダイゼーションにおける技術的精度の尺度を提供します。実験における独立したユニットを特定し、統計的有意性の過大評価を避けるために、サンプルの準備と取り扱いに関する情報が議論されることが重要です。^{[ 20 ]}

マイクロアレイデータは、プラットフォームの製造、アッセイプロトコル、分析方法に標準化が欠如しているため、交換が困難です。これはバイオインフォマティクスにおける相互運用性の問題となっています。様々な草の根オープンソースプロジェクトが、非独占的なチップで生成されたデータの交換と分析を容易にしようと試みています。

例えば、「マイクロアレイ実験に関する最小限の情報」（MIAME）チェックリストは、必要な詳細レベルを定義するのに役立ち、マイクロアレイの結果を組み込んだ論文の投稿要件として多くのジャーナルで採用されています。しかし、MIAMEは情報のフォーマットを規定していないため、多くのフォーマットがMIAMEの要件を満たすことができますが、2007年時点では、完全な意味的準拠の検証を可能にするフォーマットはありません。米国食品医薬品局（FDA）は、「マイクロアレイ品質管理（MAQC）プロジェクト」を実施しており、最終的には創薬、臨床診療、規制上の意思決定におけるマイクロアレイデータの使用を可能にする標準と品質管理指標を開発しています。^{[ 21 ]} MGED協会は、遺伝子発現実験結果と関連する注釈の表現に関する標準を開発しました。

マイクロアレイデータセットは一般的に非常に大きく、分析精度は多くの変数に影響されます。統計的な課題としては、バックグラウンドノイズの影響を考慮し、データを適切に正規化することが挙げられます。正規化方法は特定のプラットフォームに適している場合があり、商用プラットフォームの場合は、分析が独自仕様である可能性があります。^{[ 22 ]}統計分析に影響を与えるアルゴリズムには、次のものがあります。

• 画像解析：グリッド化、スキャン画像のスポット認識（セグメンテーションアルゴリズム）、低品質および低強度の特徴の除去またはマーキング（フラグ付けと呼ばれる）。
• データ処理：バックグラウンド減算（グローバルまたはローカルのバックグラウンドに基づく）、スポット強度と強度比の決定、データの可視化（MAプロットを参照）、比率の対数変換、強度比のグローバルまたはローカル正規化、ステップ検出アルゴリズムを使用した異なるコピー数領域への分割。 ^{[ 23 ]}
• クラス発見分析: この分析手法は、教師なし分類または知識発見と呼ばれることもあり、マイクロアレイ (オブジェクト、患者、マウスなど) または遺伝子がグループにクラスター化するかどうかを特定しようとします。クラスター化するオブジェクト (マイクロアレイまたは遺伝子) の自然に存在するグループを特定することで、これまで存在が知られていなかった新しいグループを発見することができます。知識発見分析では、さまざまな教師なし分類手法を DNA マイクロアレイ データに適用して、アレイの新しいクラスター (クラス) を特定できます。^{[ 24 ]}このタイプのアプローチは仮説駆動型ではなく、反復的なパターン認識または統計的学習方法に基づいて、データ内の「最適な」クラスター数を見つけます。教師なし分析方法の例には、自己組織化マップ、ニューラルガス、k-means クラスター分析、^{[ 25 ]}階層的クラスター分析、ゲノム信号処理に基づくクラスタリング、モデルベースのクラスター分析などがあります。これらの方法の一部では、ユーザーはオブジェクトのペア間の距離尺度も定義する必要があります。ピアソン相関係数が一般的に使用されますが、文献では他のいくつかの尺度が提案され評価されています。^{[ 26 ]}クラス発見分析で使用される入力データは、一般的に変動係数の値が低い、またはシャノンエントロピーの値が高いなどに基づいて情報量が多い（ノイズが少ない）遺伝子のリストに基づいています。教師なし分析から得られる最も可能性の高いまたは最適なクラスター数の決定は、クラスター妥当性と呼ばれます。クラスター妥当性によく使用される指標には、シルエット指数、デイビス・ボールディン指数、^{[ 27 ]}ダン指数、またはヒューバート指数などがあります。${\displaystyle \Gamma }$統計。
• クラス予測分析: このアプローチは教師あり分類と呼ばれ、将来の未知のテストオブジェクトを入力として、テストオブジェクトの最も可能性の高いクラスメンバーシップを予測するための予測モデルを開発するための基礎を確立します。 クラス予測のための教師あり分析^{[ 24 ]}には、線形回帰、k近傍法、学習ベクトル量子化、決定木分析、ランダムフォレスト、ナイーブベイズ、ロジスティック回帰、カーネル回帰、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、エキスパートの混合、教師ありニューラルガスなどの手法の使用が含まれます。 さらに、遺伝的アルゴリズム、共分散行列自己適応、粒子群最適化、アリコロニー最適化などのさまざまなメタヒューリスティック手法が採用されています。 クラス予測の入力データは通常、古典的な仮説検定 (次のセクション)、ジニ多様性指数、または情報利得 (エントロピー) を使用して決定された、クラスを予測する遺伝子のフィルタリングされたリストに基づいています。
• 仮説主導型統計解析: 遺伝子発現の統計的に有意な変化の特定は、一般的に、t検定、ANOVA、ベイズ法^{[ 28 ]} 、多重比較を考慮したマイクロアレイデータセットに合わせたマン・ホイットニー検定法^{[ 29 ]}、またはクラスター分析^{[ 30 ]}を使用して行われます。これらの方法は、データに存在する変動と実験の繰り返し回数に基づいて統計的検出力を評価し、解析における第一種過誤と第二種過誤を最小限に抑えるのに役立ちます^{[ 31 ] 。}
• 次元削減: アナリストは、データ分析の前に次元数 (遺伝子数) を削減することがよくあります。^{[ 24 ]}これには、主成分分析 (PCA) などの線形アプローチ、またはカーネル PCA、拡散マップ、ラプラシアン固有マップ、局所線形埋め込み、局所保存射影、および Sammon のマッピングを使用した非線形多様体学習 (距離メトリック学習) が含まれる場合があります。
• ネットワークベースの方法: 遺伝子ネットワークの根底にある構造を考慮した統計的方法であり、遺伝子産物間の関連または因果的な相互作用または依存関係を表します。^{[ 32 ]}重み付き遺伝子共発現ネットワーク分析は、共発現モジュールとモジュール内ハブ遺伝子の特定に広く使用されています。モジュールは、細胞タイプまたは経路に対応する場合があります。高度に接続されたモジュール内ハブは、それぞれのモジュールを最もよく表します。

マイクロアレイデータは、理解を容易にし、より焦点を絞った分析を行うために、データの次元を削減することを目的としたさらなる処理が必要となる場合があります。^{[ 33 ]}他の方法では、生物学的または技術的な複製数が少ないデータの分析が可能です。たとえば、ローカルプールエラー（LPE）テストでは、複製が不十分な場合を補うために、類似した発現レベルの遺伝子の標準偏差をプールします。^{[ 34 ]}

プローブと、それが検出すると予想されるmRNAとの関係は単純ではありません。 ^{[ 35 ]}一部のmRNAは、アレイ内の別のmRNAを検出するはずのプローブと交差ハイブリダイゼーションを起こす可能性があります。さらに、mRNAは配列または分子特異的な増幅バイアスを受ける可能性があります。第三に、特定の遺伝子のmRNAを検出するように設計されたプローブは、その遺伝子と誤って関連付けられているゲノムEST情報に依存している可能性があります。

マイクロアレイデータは、他の類似データセットと比較して、より有用であることが判明しました。膨大なデータ量、特殊なフォーマット（MIAMEなど）、およびデータセットに関連するキュレーション作業のため、データを保存するには専用のデータベースが必要です。InterMineやBioMartなど、多様な生物学的データセットを統合し、分析をサポートするという特定の目的のために、多くのオープンソースのデータウェアハウスソリューションが開発されています。