ベクター（分子生物学）

分子クローニングにおいて、ベクターとは、外来核酸配列（通常はDNA）を人工的に別の細胞に運び、複製および/または発現させるための媒体として使用される粒子（例：プラスミド、コスミド、ラムダファージ）である。^[1]外来DNAを含むベクターは、組み換えDNAと呼ばれる。ベクターには、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体の4つの主要な種類がある。これらのうち、最も一般的に使用されるベクターはプラスミドである。^{[2]すべての改変ベクターに共通するのは、}複製起点、マルチクローニング部位、および選択マーカーである。

ベクター自体は、一般的に、インサート（この場合はトランスジーン）とベクターの「バックボーン」として機能するより大きな配列からなるDNA配列を運びます。遺伝情報を別の細胞に転送するベクターの目的は、通常、標的細胞でインサートを分離、増殖、または発現させることです。すべてのベクターはクローニングに使用できるため、クローニングベクターと呼ばれますが、クローニング専用に設計されたベクターや、転写やタンパク質発現などの他の目的専用に設計されたベクターもあります。標的細胞でのトランスジーンの発現用に特別に設計されたベクターは、発現ベクターと呼ばれ、一般的にトランスジーンの発現を促進するプロモーター配列を持っています。転写ベクターと呼ばれるより単純なベクターは、転写のみが可能で翻訳はできません。つまり、発現ベクターとは異なり、標的細胞で複製できますが、発現することはできません。転写ベクターは、インサートを増幅するために使用されます。

DNAの操作は通常、大腸菌ベクター上で行われ、 大腸菌内での維持に必要な要素が含まれています。しかし、ベクターには酵母、植物、哺乳類細胞などの他の生物内で維持できる要素が含まれている場合もあり、これらのベクターはシャトルベクターと呼ばれます。このようなベクターには細菌またはウイルスの要素が含まれており、非細菌宿主生物に伝達される可能性がありますが、外来種からの遺伝物質の伝達を回避するために、遺伝子内ベクターと呼ばれる他のベクターも開発されています。^[3]

標的細胞へのベクターの挿入は、細菌細胞の場合は形質転換^[4] 、真核細胞の場合はトランスフェクション^{[5]と呼ばれることが多いが、ウイルスベクターの挿入は形質導入}^[6]と呼ばれることが多い。

特徴

プラスミド

プラスミドは、宿主細胞の複製機構を使用して複製できる、染色体外の二本鎖で通常は環状のDNA配列です。^[7]プラスミドベクターは、最小限ではありますが、宿主内でのプラスミドの半独立複製を可能にする複製起点で構成されています。プラスミドは、大腸菌など多くの細菌に広く見られますが、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母など、いくつかの真核生物にも見られます。^[8]細菌プラスミドは、接合性/伝達性と非接合性があります。

接合性 - 接合を通じて DNA の移動を仲介し、その結果、集団内の細菌細胞間で急速に広がります。例: F プラスミド、多くの R プラスミド、および一部の col プラスミド。
非接合性 - 接合を通じて DNA を媒介しません (例: 多くの R および col プラスミド)。

特別に構築された機能を持つプラスミドは、クローニングの目的で研究室でよく使用されます。これらのプラスミドは一般に非接合性ですが、さらに多くの機能、特に複数の制限酵素切断部位によってトランスジーン挿入物の挿入を可能にする「多重クローニング部位」を持つ場合があります。プラスミドを含む細菌は、数時間で細菌内で数百万のベクターのコピーを生成することができ、増幅されたベクターは細菌から抽出してさらに操作することができます。プラスミドは特に転写ベクターとして使用される可能性があり、そのようなプラスミドにはタンパク質発現に不可欠な配列が欠けている場合があります。タンパク質発現に使用されるプラスミドは発現ベクターと呼ばれ、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドンなどのタンパク質翻訳の要素が含まれます。

ウイルスベクター

ウイルスベクターは、非感染性にされた改変ウイルス DNA または RNA を運ぶ遺伝子組み換えウイルスですが、ウイルスプロモーターとトランスジーンがまだ含まれているため、ウイルスプロモーターを介してトランスジーンの翻訳が可能です。ただし、ウイルスベクターには感染性配列が欠けていることが多いため、大規模なトランスフェクションにはヘルパーウイルスまたはパッケージングラインが必要です。ウイルスベクターは、挿入物を宿主ゲノムに永久に組み込むように設計されることが多く、トランスジーンを組み込んだ後、宿主ゲノムに明確な遺伝子マーカーを残します。たとえば、レトロウイルスは、挿入後に特徴的なレトロウイルス統合パターンを残します。これは検出可能であり、ウイルスベクターが宿主ゲノムに組み込まれたことを示します。

人工染色体

人工染色体は、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはヒト人工染色体（HAC）の文脈で製造された染色体です。人工染色体は、他のベクターよりもはるかに大きなDNA断片を運ぶことができます。 ^[9] YACとBACは、最大300,000ヌクレオチド長のDNA断片を運ぶことができます。人工染色体の3つの構造上の必須要素には、複製起点、セントロメア、およびテロメア末端配列が含まれます。^[10]

転写

クローン化された遺伝子の転写は、遺伝子の発現が必要な場合のベクターの必須要素です。1つの遺伝子が転写によって増幅され、 mRNAの複数のコピーが生成され、そのテンプレートに基づいて翻訳によってタンパク質が生成されます。^[11] mRNAの数が多いほど、発現するタンパク質の量も多くなり、生成されるmRNAのコピー数はベクターで使用されるプロモーターによって異なります。^[12]発現は構成的である場合があり、つまりタンパク質がバックグラウンドで絶えず生成される場合と、誘導性である場合があり、その場合、タンパク質は、たとえば化学誘導剤が追加されたときなど、特定の条件下でのみ発現されます。これら2つの異なるタイプの発現は、使用するプロモーターとオペレーターのタイプによって異なります。

ウイルスプロモーターは、多くの細胞株や細胞型で確実に一定の転写を強制するため、プラスミドやウイルスベクターでの構成的発現によく使用されます。^[13]誘導発現は、誘導条件に応答するプロモーターに依存します。たとえば、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターはデキサメタゾンの適用後にのみ転写を開始し、ショウジョウバエ熱ショックプロモーターは高温後にのみ転写を開始します。

一部のベクターは、 in vitro mRNA 生成など、転写のみを目的として設計されています。これらのベクターは転写ベクターと呼ばれます。ポリアデニル化と終結に必要な配列が欠落している場合があり、そのためタンパク質生成には使用できないことがあります。

表現

発現ベクターは、ベクターの挿入部分の転写と、それに続く生成されたmRNAの翻訳を通じてタンパク質を生成するため、より単純な転写のみのベクターよりも多くのコンポーネントを必要とします。異なる宿主生物における発現には、転写開始のためのプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および終了シグナルなど、同様の要件を共有していますが、必要な要素は異なります。

原核生物発現ベクター

プロモーター - 一般的に使用される誘導性プロモーターは、lacオペロンから派生したプロモーターとT7プロモーターです。使用される他の強力なプロモーターには、Trp プロモーターとTac プロモーターがあり、これらは Trp オペロンプロモーターと Lac オペロンプロモーターの両方のハイブリッドです。
リボソーム結合部位(RBS) - プロモーターの後に続き、目的のタンパク質の効率的な翻訳を促進します。
翻訳開始部位 - RBS で囲まれたShine-Dalgarno 配列、AUG 開始コドンの 8 塩基対上流。

真核生物発現ベクター

真核生物発現ベクターには、以下をコードする配列が必要です。

ポリアデニル化テール: 転写されたプレ mRNA の末端にポリアデニル化テールを作成し、mRNA をエキソヌクレアーゼから保護し、転写および翻訳の終結を確実にして、mRNA の生成を安定化します。
最小のUTR長: UTR には転写や翻訳を妨げる可能性のある特定の特性が含まれているため、最適な発現ベクターでは UTR が最短にエンコードされるか、UTR がまったくエンコードされません。
Kozak 配列: ベクターは、 mRNA の翻訳のためにリボソームを組み立てる mRNA 内の Kozak 配列をコードする必要があります。

特徴

現代の人工的に構築されたベクターには、すべてのベクターに見られる必須コンポーネントが含まれており、一部のベクターにのみ見られるその他の追加機能も含まれている場合があります。

複製起点: 宿主細胞内でのベクターの複製と維持に必要です。
プロモーター: プロモーターは、ベクターのトランスジーンだけでなく、抗生物質耐性遺伝子などのベクター内の他の遺伝子の転写を促進するために使用されます。一部のクローニングベクターでは、クローン化された挿入物にプロモーターは必要ありませんが、クローン化された産物を発現させるためには、プロモーターは発現ベクターの必須コンポーネントです。
クローニングサイト: これは、複数のクローニングサイト、またはライゲーションを通じてベクターに外来 DNA を挿入できるその他の機能である可能性があります。
遺伝子マーカー: ウイルスベクターの遺伝子マーカーにより、ベクターが宿主ゲノム DNA に組み込まれたことを確認できます。
抗生物質耐性: 抗生物質耐性オープンリーディングフレームを持つベクターは、抗生物質選択を通じて、抗生物質を含む増殖培地でベクターを取り込んだ細胞の生存を可能にします。
エピトープ: 一部のベクターには、発現したタンパク質に組み込むことができる特定のエピトープの配列が含まれている場合があります。これにより、標的タンパク質を発現している細胞の抗体識別が可能になります。
レポーター遺伝子: 一部のベクターには、挿入された DNA 配列を含むプラスミドの識別を可能にするレポーター遺伝子が含まれている場合があります。一例として、ガラクトースを消化する酵素であるβ-ガラクトシダーゼの N 末端フラグメントをコードするlacZ-αがあります。 lacZ-α内には多重クローニングサイトがあり、ベクターに挿入に成功すると遺伝子配列が破壊され、不活性な β-ガラクトシダーゼが生成されます。挿入物を含むベクターを含む細胞は、ガラクトース類似体( X-gal ) を含む培地で細胞を増殖させることにより、青/白選択を使用して識別できます。 β-ガラクトシダーゼを発現している細胞 (したがって挿入物を含まない) は、青いコロニーとして表示されます。挿入物を含む可能性がある白いコロニーとして選択されます。他のよく使用されるレポーターには、緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼがあります。
標的配列: 発現ベクターには、完成したタンパク質内の標的配列のコードが含まれる場合があり、この配列によって発現したタンパク質が細胞内の特定の細胞小器官または細菌の細胞周縁部などの特定の場所に誘導されます。
タンパク質精製タグ: 一部の発現ベクターには、発現したタンパク質の精製を容易にするタンパク質またはペプチド配列が含まれています。例としては、ポリヒスチジンタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などがあります。これらのタグの一部は、標的タンパク質の溶解性を高めることもできます。標的タンパク質はタンパク質タグに融合されていますが、タンパク質とタグの間のポリペプチドリンカー領域に位置するプロテアーゼ切断部位により、後でタグを取り除くことができます。

参照

参考文献

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さらに読む

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外部リンク

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