二次元クロマトグラフィー

タンデム質量分析法（タンデムMSまたはMS/MS）は、2つの質量分析器を直列に使用して、より複雑な分析対象物の混合物を分離します。タンデムMSの利点は、他の2次元法よりもはるかに高速で、ミリ秒から秒の範囲の時間で分析できることです。^{[ 5 ]} MSでは溶媒による希釈がないため、干渉の可能性が低く、タンデムMSは他の2次元法と比較して感度が高く、信号対雑音比が高くなります。タンデムMSの主な欠点は、必要な装置のコストが高いことです。価格は50万ドルから100万ドルを超える場合があります。^{[ 6 ]}多くのタンデムMSの形式には、質量選択ステップとフラグメンテーションステップが含まれます。最初の質量分析器は、特定の質量電荷比の分子のみを通過させるようにプログラムできます。次に、2番目の質量分析器は、分子をフラグメント化してその同一性を決定します。これは、同じ質量の分子（たとえば、同じ質量のタンパク質または分子異性体）を分離するのに特に役立ちます。さまざまな効果を得るために、異なるタイプの質量分析計を組み合わせることができます。一例として、飛行時間型質量分析計（ TOF）と四重極を組み合わせたシステムがあります。イオンは、TOFからm/zの増加順に放出される際に、四重極で順次フラグメント化および/または分析されます。もう一つの一般的なタンデム質量分析計は、四重極-四重極-四重極（QQQ）分析計です。最初の四重極で質量分離を行い、2番目の四重極で衝突を起こし、3番目の四重極でフラグメントを質量分離します。

ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）は、ガスクロマトグラフィーの分離技術と質量分析法の同定技術を組み合わせた二次元クロマトグラフィー技術です。GC-MSは、複雑な混合物中の揮発性および半揮発性有機化合物の分析において最も重要な分析ツールです。^{[ 7 ]} GC- MSは、まずサンプルをGC入口に注入し、そこで気化させて、通常はヘリウムであるキャリアガスによってカラムに押し通すことで機能します。サンプル中の分析対象物は、カラムのコーティング（固定相）とキャリアガス（移動相）との相互作用に基づいて分離されます。^{[ 8 ]}カラムから溶出された化合物は、質量分析器を通過する前に、電子衝撃イオン化（EI）または化学イオン化（CI）によってイオンに変換されます。 ^{[ 9 ]}質量分析器は、質量電荷比に基づいてイオンを分離する役割を果たします。一般的な選択肢は同じ機能を果たしますが、分離の達成方法が異なります。^{[ 10 ]} GC-MSで一般的に使用される分析装置は、飛行時間型質量分析計と四重極型質量分析計です。^{[ 8 ]}質量分析計を出た後、分析対象物は検出器に到達し、コンピューターによって読み取られ、ガスクロマトグラムと質量スペクトルを作成するために使用される信号を生成します。GC-MSでは、特に複雑なサンプルで2台のガスクロマトグラフを使用して、かなりの分離能を得て、特定の種を適切なピークに明確に割り当てることができるGCxGC-(MS)と呼ばれる技術を使用する場合があります。^{[ 11 ]}最終的に、GC-MSは多くの分析ラボで使用されている技術であり、非常に効果的で適応性の高い分析ツールです。

液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）は、高分解能クロマトグラフィー分離と質量分析検出を組み合わせた分析法です。このシステムは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の高い分離能を採用しているため、液体移動相中の分析対象物質は、大気圧化学イオン化（APCI）、エレクトロスプレーイオン化（ESI） 、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）などの様々なソフトイオン化法によってイオン化され、質量分析との組み合わせに必要な気相イオン化を実現します。これらのイオン化法を用いることで、質量が大きいもの、熱的に不安定なもの、揮発性の低いものなど、GC-MSでは通常分析できないような幅広い生体分子の分析が可能になります。

LC-MSは、特定の質量を選択することで未分離のピークを分離できるため、高い選択性を提供します。さらに、質量スペクトルによってより優れた同定も達成され、ユーザーは分析対象物の保持時間だけに頼る必要がありません。その結果、 LC-MSを介して、分子量と構造情報、および定量データをすべて取得できます。^{[ 9 ]}したがって、LCは不純物の効率的な分離を提供し、MSは不純物プロファイリングのための構造特性を提供するので、LC-MSは、医薬品開発および医薬品製造における不純物の同定とプロファイリングなど、さまざまな分野に適用できます。^{[ 12 ]}

水、アセトニトリル、メタノールなど、順相または逆相LCで一般的に使用される溶媒はすべてESIと互換性がありますが、LCグレードの溶媒はMSには適さない場合があります。さらに、無機イオンを含む緩衝液はイオン源を汚染する可能性があるため避けるべきです。^{[ 13 ]}それにもかかわらず、この問題は2D LC-MSによって解決でき、分析対象物の共溶出やUV検出応答などの他のさまざまな問題も解決できます。^{[ 14 ]}

二次元液体クロマトグラフィー（2D-LC）は、2つの独立した液体クロマトグラフィー分析を1つのデータ解析に統合したものです。現代の2D液体クロマトグラフィーは、1970年代後半から1980年代初頭に誕生しました。この間、2D-LCの原理は、実験と概念的・理論的な研究を併用することで実証されました。2D-LCは、従来の一次元液体クロマトグラフィーに比べて、はるかに高い分離能を持つことが示されました。1990年代には、2D-LC技術は、プロテオミクスやポリマー研究分野で見られる極めて複雑な物質や材料の分離において重要な役割を果たしました。しかしながら、分析時間に関しては大きな欠点があることが明らかになりました。初期の2D-LCを用いた研究は、装置の分析時間が長いため、液相分離のごく一部に限定されていました。現代の2D-LC技術は、この欠点に正面から取り組み、かつては大きな問題であった分析時間を大幅に短縮しました。最新の2D-LCは、1時間以内に高分解能分離を完了できる装置能力を備えています。より複雑な物質の分析と検出限界の向上に対する装置のニーズの高まりに伴い、2D-LCの開発が急速に進んでいます。装置部品は業界の主流となり、以前よりもはるかに容易に入手できるようになりました。以前は、2D-LCは1D-LC装置の部品を使用して行われており、精度と正確さの両方において結果にばらつきがありました。装置工学への負担が軽減されたことで、2D-LCの分野と技術における先駆的な研究が可能になりました。

この技術を用いる目的は、一次元液体クロマトグラフィーでは効果的に分離できない混合物を分離することにある。二次元液体クロマトグラフィーは、尿、環境物質、血液などの法医学的証拠といった複雑な混合物サンプルの分析に適している。

混合物の分離が困難なのは、化合物中の異なる溶出液の数が多いため分離が不可能であるという意味で、混合物の複雑さに起因する。一次元液体クロマトグラフィーに関連するもう 1 つの問題は、類似した化合物の分離の難しさである。類似した化合物は、極性、電荷などに基づいて分離するのが難しい類似した化学的性質を持つ可能性がある。^{[ 15 ]}二次元液体クロマトグラフィーは、複数の化学的または物理的性質に基づいて分離を提供する。Nagy と Vekey の例を使用すると、ペプチドの混合物は塩基性に基づいて分離できるが、類似したペプチドはうまく溶出しない可能性がある。後続の LC 技術を使用すると、ペプチド間の類似した塩基性を非極性特性の違いを利用してさらに分離することができる。^{[ 16 ]}

その結果、混合物をより効率的に分離できるようにするには、後続のLC分析では、最初のカラムとは全く異なる分離選択性を用いる必要がある。BusheyとJorgensonによれば、2D液体クロマトグラフィーを効果的に使用するためのもう1つの要件は、高度に直交する技術を用いることであり、これは2つの分離技術が可能な限り異なっている必要があることを意味する。^{[ 17 ]}

2D液体クロマトグラフィーには大きく分けて2つの分類があります。これらは、包括的2D液体クロマトグラフィー（LCxLC）とハートカッティング2D液体クロマトグラフィー（LC-LC）です。^{[ 18 ]}包括的2D-LCでは、カラム溶出からのすべてのピークが完全にサンプリングされますが、サンプル全体を最初のカラムから2番目のカラムに移す必要はないとされています。サンプルの一部は廃棄され、残りはサンプリングバルブに送られます。ハートカッティング2D-LCでは、特定のピークがターゲットとなり、ピークのごく一部だけが2番目のカラムに注入されます。ハートカッティング2D-LCは、保持挙動が類似している限り、それほど複雑でない物質のサンプル分析に非常に有用であることが証明されています。包括的2D-LCと比較して、ハートカッティング2D-LCは、システム設定がはるかに少なく、運用コストがはるかに低い効果的な手法を提供します。マルチハートカッティング（mLC-LC）を使用すると、2次元分析の一時的な重複のリスクなしに、1次元分析から複数​​のピークをサンプリングできます。^{[ 18 ]}マルチプルハートカッティング（mLC-LC）は、複数のサンプリングループのセットアップを利用します。

2D-LCでは、ピーク容量が非常に重要な問題です。これは、適切な時間があれば、等溶媒分離よりもはるかに効率的にグラジエント溶出分離を使用して生成できます。等溶媒溶出は高速時間スケールでははるかに簡単ですが、2次元目ではグラジエント溶出分離を実行する方が好ましいです。移動相の強度は、弱い溶出液組成から強い溶出液組成へと変化します。逆相クロマトグラフィーのグラジエント溶出の線形溶媒強度理論（LSST）に基づいて、保持時間、機器変数、および溶質パラメータの関係を以下に示します。^{[ 18 ]}

t _R =t ₀ +t _D + t ₀ /b*ln(b*(k ₀ -t _d /t ₀ ) + 1)

2次元液体クロマトグラフィー（2D-LC）が主要な分析クロマトグラフィー技術となって以来、多くの先駆的な研究が行われてきたものの、依然として多くの現代的な課題が残されている。未解決の実験変数も数多く存在し、この技術は常に発展途上にある。

包括的二次元ガスクロマトグラフィーは、複雑な混合物を分離・分析する分析技術です。香料、環境研究、医薬品、石油製品、法医学などの分野で活用されています。GCxGCは、ピーク容量の増加により、高い感度範囲と優れた分離能を実現します。