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大規模並列シーケンシング（MPS）は、大規模並列処理の概念を用いた、 DNAシーケンシングに対するいくつかのハイスループットアプローチのいずれかであり、次世代シーケンシング（NGS）または第2世代シーケンシングとも呼ばれます。これらの技術の一部は1993年から1998年の間に登場し[ 1 ] [2][3][ 4 ] [ 5 ] 、 2005年から市販されています。これらの技術は、小型化され並列化されたプラットフォームを使用して、1回の機器実行で100万から430億のショートリード（それぞれ50から400塩基）をシーケンシングします。
多くのNGSプラットフォームは、エンジニアリング構成とシーケンス化学において異なっている。それらは、空間的に分離されたクローン増幅DNAテンプレートまたはフローセル内の単一DNA分子を介した大規模並列シーケンスという技術的パラダイムを共有している。この設計は、個々のシーケンス反応で生成された鎖終結産物の電気泳動分離に基づくサンガーシーケンス（キャピラリーシーケンスまたは第一世代シーケンスとも呼ばれる）とは大きく異なる。 [ 6 ]この方法論により、より大規模なシーケンスが可能になる。[ 7 ]
1990年代には、Applied Biosystems社が自動キャピラリー電気泳動サンガーシーケンシング装置でDNAシーケンシング技術を支配していました。しかし、2000年代初頭には、ヒトゲノムプロジェクトによって生み出された熱狂を受けて、ゲノムシーケンシングのコストを1,000ドル以下に削減するという目標に駆り立てられ、多くの新規企業が市場に参入しました。[ 8 ]これらの新しい方法の多くは、国立衛生研究所（NIH）の「1,000ドルゲノムのための技術開発」プログラム[ 9 ]の資金援助を受けて最初に開発されました。このプログラムは、フランシス・コリンズが国立ヒトゲノム研究所の所長を務めていた時期に開始されました。[ 10 ]
最初の次世代シーケンサーは、パイロシーケンシングに基づいており、元々は Pyrosequencing AB によって開発され、後に454 Life Sciencesによって商品化されました。2003 年に、454 Life Sciences は最初の NGS DNA シーケンサーである GS20 を発表しました。このシステムは、約 400 ～ 500 bp の長さのリードを 99% の精度で提供し、サンガー シーケンシングと比較して大幅に低いコストで 4 時間の実行で約 2500 万塩基のシーケンスを可能にしました。[ 11 ] 454 が開発したシーケンシングマシンは、シーケンス反応の大量並列化を可能にすることでパラダイムシフトを表し、実行ごとにシーケンスされる DNA の量を大幅に増加させ、454 Life Sciences を商用 NGS 技術の最初の大きな成功に導きました。[ 12 ]
また、2003年にSolexaは、 Sequencing by Synthesis (SBS)と呼ばれる競合手法の開発を開始しました。2004年、SolexaはManteiaからコロニーシーケンス（ブリッジ増幅）技術を取得し、フローセル上に固定された高密度クラスターDNA断片（「ポロニー」）を生成しました。これらの高密度クラスターはより強い蛍光シグナルを生成し、精度を向上させ、光学コストを削減しました。2005年、Solexaは、設計されたDNAポリメラーゼと可逆的ターミネーターヌクレオチドを統合し、シーケンスとイメージングの繰り返しサイクルを可能にしました。この技術に基づく最初の商用シーケンサーであるGenome Analyzerは2006年に発売され、より短いリード（約35 bp）とより高いスループット（1ランあたり最大1 Gbp）と、DNA断片の両端をシーケンスするペアエンドシーケンス機能を提供しました。[ 13 ]
2007年、454 Life SciencesはRocheに買収され[ 14 ]、SolexaはIlluminaに買収された[ 15 ] 。同年、Applied BiosystemsはライゲーションベースのシーケンスプラットフォームであるSOLiDを発表した[ 16 ] 。しかし、SOLiDは回文領域のシーケンスで問題に直面し[ 17 ]、最終的に販売中止となった[ 8 ] 。 2011年、Ion Torrentは半導体ベースのセンサーを使用してヌクレオチドの取り込み中のプロトン（pH）の変化を測定する別の代替手段を発表した[ 18 ] 。Ion Torrentシステムは100 bpのリードを迅速に生成したが、ホモポリマーの正確なシーケンスに頻繁に苦労し[ 19 ] 、最終的に放棄された[ 8 ] 。
競合する手法の限界により、イルミナのSBS技術は最終的にシーケンス市場を席巻しました。[ 8 ] 2012年までに、454がシーケンス市場で相当なシェアを獲得するという期待は実現せず、ロシュによる2007年の買収はますます期待外れと見なされるようになりました。同年、ロシュはイルミナの買収を試みましたが失敗に終わりました。[ 14 ] 2013年10月、ロシュは454を閉鎖し、2016年半ばまでにプラットフォームのサポートを終了すると発表しました。[ 20 ] 2014年までに、イルミナはDNAシーケンサー販売の約70%を支配し、シーケンスデータの90%以上を生成しました。[ 21 ] [ 22 ]同年、イルミナはHiSeq X Tenプラットフォームを発表し、スループットを大幅に向上させ、ヒトゲノムのシーケンスを1つあたり約1000ドルで実現するという長年の目標を掲げました。[ 23 ]イルミナは2017年に、1回のランで3000ギガビットを超えるデータを生成できるシステムであるNovaSeqをリリースし、このマイルストーンを上回りました。[ 8 ]
シーケンスデータの需要の継続的な増加と、2023年にイルミナの主要特許のいくつかが期限切れになったことにより、ショートリードシーケンスの競合企業が次々と現れ、それぞれが独自の化学、フローセル設計、スループットレベル、コスト構造をもたらしました。[ 24 ] 2020年代初頭までに、イルミナの合成によるシーケンスプラットフォームは依然として優位を占めていました。2023年の概要では、2022年の世界のシーケンスデータの90%以上がイルミナの機器で生成されたと推定されています。[ 25 ]競合企業には、イルミナ式のブリッジ増幅ではなくDNAナノボールを使用するDNBSEQプラットフォームを提供するMGI Techや、スピニングディスクフローセルを使用した生産規模のプラットフォームを開発したUltima Genomicsなどがありました。 [ 25 ] Singular Genomics は2021 年後半に G4 シーケンシング プラットフォームを発表し、Element Biosciencesは 2022 年 3 月に AVITI シーケンシングを発表してそれに続き、PacBio は後に、2022 年 10 月に発表された Onso ベンチトップ プラットフォームでショート リードの分野に参入しました。[ 26 ]
イルミナのNovaSeq Xシリーズは2023年に出荷が開始され、再設計されたフローセル、更新されたシーケンス化学、およびアップグレードされた光学系が採用されました。イルミナは、このシステムは以前のNovaSeq 6000と比較して1回のランで最大3倍のデータ量を生成でき、フル活用すればヒトゲノムのシーケンスコストを約200米ドルに削減できると述べています。[ 25 ]
PacBioのショートリード市場への関与は短命に終わった。2023年にOnsoショートリードプラットフォームを発売した後、同社は2026年1月にショートリードシーケンス技術に関連する特定の知的財産およびその他の資産をIlluminaに売却した。[ 27 ] [ 28 ]
市販のNGSプラットフォームを用いたDNAシーケンスは、一般的に以下の手順で行われます。まず、DNAシーケンスライブラリは、in vitroでのPCR によるクローン増幅によって生成されます。次に、DNAは合成によってシーケンスされ、DNA配列は鎖終結化学ではなく、相補鎖へのヌクレオチドの付加によって決定されます。最後に、空間的に分離された増幅DNAテンプレートは、物理的な分離ステップを必要とせずに、大規模並列方式で同時にシーケンスされます。これらの手順はほとんどのNGSプラットフォームで実行されますが、それぞれ異なる戦略を採用しています。[ 29 ]
NGSによるシーケンス反応の並列化により、1回の機器実行で数百メガベースからギガベースのヌクレオチド配列リードが生成されます。これにより、利用可能なシーケンスデータが劇的に増加し、生物医学分野におけるゲノムシーケンスアプローチが根本的に変化しました。[ 30 ] 新たに登場したNGS技術と機器は、シーケンスコストの大幅な低下にさらに貢献し、2022年にはゲノムシーケンスあたり500ドルに近づいています。 [ 31 ]
2014年現在、超並列シーケンシングプラットフォームは市販されており、その特徴は表にまとめられています。NGS技術は急速に進歩しているため、技術仕様や価格は常に変動しています。
シングルエンドシーケンスの実行時間と、1回の実行あたりのギガベース（Gb）出力が記録されています。ペアエンドシーケンスを実行すると、実行時間と出力は約2倍になります。‡Roche 454およびHelicos Biosciencesプラットフォームの平均リード長。[ 43 ]
次世代シーケンシング（NGS）反応用のテンプレートを準備するには、単一DNA分子由来の増幅テンプレートと、単一DNA分子テンプレートの2つの方法が用いられます。単一の蛍光イベントを検出できないイメージングシステムでは、DNAテンプレートの増幅が必要です。最も一般的な増幅方法は、エマルジョンPCR（emPCR）、ローリングサークルPCR、固相増幅の3つです。テンプレートの最終的な分布は、空間的にランダムな場合も、グリッド状になる場合もあります。
エマルジョンPCR法では、まずゲノムDNAをランダムに断片化してDNAライブラリーを作成します。一本鎖DNA断片（テンプレート）はアダプターまたはリンカーでビーズの表面に結合し、1つのビーズがDNAライブラリーの1つのDNA断片に結合します。ビーズの表面には、 DNA断片に結合するアダプターに相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドプローブが含まれています。次に、ビーズは水-油エマルジョン液滴に区画化されます。水性水-油エマルジョンでは、1つのビーズを捕捉する各液滴がPCRマイクロリアクターとなり、単一のDNAテンプレートの増幅コピーを生成します。[ 44 ] [ 45 ] [ 46 ]
溶液中でローリングサークル増幅により単一DNA分子の集団を増幅した後、固定化するDNAよりも小さいサイズのスポットのグリッド上に捕捉する。[ 47 ] [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ] MGI TechのDNBSEQやElement BiosciencesのAVITIなどの第2世代シーケンシング技術では、このアプローチを使用してフローセル上にサンプルを準備し、サイクルごとに画像化する。
順方向プライマーと逆方向プライマーは、フローセル内のスライドに高密度で共有結合される。支持体上のプライマーとテンプレートの比率によって、増幅されたクラスターの表面密度が決まる。フローセルはポリメラーゼによる伸長反応用の試薬に曝され、ライゲーションされた断片の遊離末端が表面上の相補的なオリゴヌクレオチドに「架橋」することでプライミングが起こる。変性と伸長を繰り返すことで、フローセル表面上の数百万箇所でDNA断片が局所的に増幅される。固相増幅により、空間的に分離された1億～2億個のテンプレートクラスターが生成され、遊離末端にユニバーサルシーケンスプライマーをハイブリダイズさせてシーケンス反応を開始する。[ 44 ] [ 45 ]この技術は、1997 年に Glaxo-Welcome のジュネーブ生物医学研究所 (GBRI) のPascal Mayer、Eric Kawashima、Laurent Farinelliによって特許出願され、 [ 4 ] [ 5 ] 1998 年に初めて公開されました。[ 51 ] 1994 年にChris Adamsと Steve Kron は、類似しているがクローンではない表面増幅法である「ブリッジ増幅」[ 3 ]の特許を出願し、 1997 年に Church と Mitra によってクローン増幅に応用されました。[ 47 ] [ 48 ]
DNA増幅を必要とするプロトコルは、実装が煩雑な場合が多く、シーケンスエラーを引き起こす可能性があります。単一分子テンプレートの調製はより簡単で、増幅テンプレートにエラーを引き起こす可能性のあるPCRを必要としません。ATリッチおよびGCリッチのターゲット配列は増幅バイアスを示すことが多く、その結果、ゲノムアライメントおよびアセンブリで過小評価されます。単一分子テンプレートは通常、少なくとも3つの異なるアプローチのいずれかを使用して固体支持体に固定されます。最初のアプローチでは、空間的に分布した個々のプライマー分子が固体支持体に共有結合されます。開始材料をランダムに小さなサイズ（たとえば、約200～250 bp）に断片化し、断片の末端に共通アダプターを追加することによって調製されたテンプレートは、固定化されたプライマーにハイブリダイズされます。2番目のアプローチでは、空間的に分布した単一分子テンプレートが、固定化されたプライマーから一本鎖単一分子テンプレートをプライミングおよび伸長することによって固体支持体に共有結合されます。次に、共通プライマーがテンプレートにハイブリダイズされます。どちらの方法においても、DNAポリメラーゼは固定化されたプライマー付きテンプレート構造に結合してNGS反応を開始できます。上記の2つの方法はいずれもHelicos BioSciences社で使用されています。3つ目の方法では、空間的に分散した単一のポリメラーゼ分子が固体支持体に固定され、そこにプライマー付きテンプレート分子が結合されます。この方法はPacific Biosciences社で使用されています。この技術では、より大きなDNA分子（最大数万塩基対）を使用でき、最初の2つの方法とは異なり、3つ目の方法はリアルタイム法と併用できるため、より長いリード長が得られる可能性があります。
合成によるシーケンシング（SBS）の目的は、DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みを検出することによって、DNAサンプルの配列を決定することです。人工ポリメラーゼを使用してDNAの一本鎖のコピーを合成し、各ヌクレオチドの取り込みを監視します。合成によるシーケンシングの原理は1993年に初めて記述され[ 1 ]、数年後に改良版が発表されました[ 52 ] 。SBSのすべての実施形態の主要部分は非常に似ており、(1)後続のシグナルを増強し、配列決定するDNAを固体支持体に付着させるためのDNAの増幅、(2)固体支持体上での一本鎖DNAの生成、(3)人工ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの取り込み、(4)ヌクレオチドの取り込みの検出が含まれます。次に、ステップ3～4を繰り返し、ステップ4で得られたシグナルから配列を組み立てます。この合成によるシーケンス決定の原理は、454、PacBio、IonTorrent、Illumina、MGIなど、ほぼすべての超並列シーケンス装置で使用されています。
パイロシークエンシングの原理は、1993年に初めて記述されました[ 1 ]。固体支持体と、3'から5'エキソヌクレアーゼ活性（校正）を欠くように設計されたDNAポリメラーゼ、およびホタルルシフェラーゼを使用した発光リアルタイム検出を組み合わせたものです。合成によるシークエンシングのすべての重要な概念が導入されました。これには、（1）後続のシグナルを増強し、シークエンシングするDNA（テンプレート）を固体支持体に結合させるためのDNAの増幅、（2）固体支持体上での一本鎖DNAの生成、（3）設計されたポリメラーゼを使用したヌクレオチドの組み込み、および（4）光検出による組み込みヌクレオチドのリアルタイム検出が含まれます。続編論文[ 2 ]では、この概念がさらに発展し、1998年には論文[ 52 ]が発表され、著者らは、未結合ヌクレオチドを4番目の酵素（アピラーゼ）で除去することで、未結合ヌクレオチドを洗い流す必要なく合成による配列決定を行うことができることを示した。
このアプローチでは、ヌクレオチドの取り込み、蛍光イメージング、切断からなる循環法で可逆的ターミネーター結合dNTPを使用します。蛍光標識されたターミネーターは、各dNTPが添加されるたびにイメージングされ、その後切断されて次の塩基の取り込みが可能になります。これらのヌクレオチドは化学的にブロックされているため、各取り込みは固有のイベントです。各塩基の取り込みステップの後にイメージングステップがあり、その後、ブロックされたグループが化学的に除去され、各鎖がDNAポリメラーゼによる次の取り込みに備えられます。この一連のステップは、ユーザーが定義した機器設定によって決定される特定のサイクル数だけ続きます。3'ブロッキンググループは、当初、酵素的[ 53 ]または化学的反転[ 34 ] [ 35 ]として考案されました。化学的方法は、SolexaおよびIlluminaマシンの基礎となっています。可逆的ターミネーター化学によるシーケンスは、Illumina/Solexa が使用するような 4 色サイクル、または Helicos BioSciences が使用するような 1 色サイクルのいずれかです。Helicos BioSciences は、阻害剤として作用する 2 番目のヌクレオシド類似体を持つ非ブロック ターミネーターである「仮想ターミネーター」を使用しました。これらのターミネーターは、DNA 合成が 1 つの塩基の追加後に終了するように、終結または阻害グループに適切な修飾が施されています。[ 45 ] [ 54 ] [ 55 ]
この方法では、配列伸長反応はポリメラーゼではなく、DNAリガーゼと1塩基エンコードプローブまたは2塩基エンコードプローブによって行われます。最も単純な形式では、蛍光標識プローブがプライマー付きテンプレートに隣接する相補配列にハイブリダイズします。次に、DNAリガーゼが添加され、色素標識プローブがプライマーに結合します。結合していないプローブは洗い流され、続いて蛍光イメージングによって結合したプローブの同一性が決定されます。このサイクルは、切断可能なプローブを使用して蛍光色素を除去し、次のライゲーションサイクル用に5′-PO4基を再生することによって（連鎖ライゲーション[ 36 ] [ 56 ]）、または除去して新しいプライマーをテンプレートにハイブリダイズすることによって（非連鎖ライゲーション[ 38 ] [ 39 ]）繰り返すことができます。
Pacific Biosciencesは現在この方法をリードしています。リアルタイム シーケンシング法では、DNA 合成中に色素標識ヌクレオチドが連続的に取り込まれる様子を画像化します。個々のゼロ モード導波路検出器 (Zmw 検出器) の底面に単一の DNA ポリメラーゼ分子が取り付けられ、リン酸結合ヌクレオチドが成長中のプライマー鎖に取り込まれる間に配列情報を取得できます。Pacific Biosciences は、リン酸結合ヌクレオチドをより効率的に取り込み、閉環状テンプレートの再シーケンシングを可能にする独自の DNA ポリメラーゼを使用しています。シングル リードの精度は 87% ですが、マルチ キロ ベースのリード長でコンセンサス精度が 99.999% であることが実証されています。[ 57 ] [ 58 ] 2015 年に Pacific Biosciences は、容量を約 6.5 倍に増加させた Sequel System と呼ばれる新しいシーケンシング装置をリリースしました。[ 59 ] [ 60 ]
コロニー大規模並列シーケンスams98プレゼンテーション