ナノポアシーケンシング

ナノポアシーケンシングは、生体高分子、特にDNAまたはRNAの形態のポリヌクレオチドのシーケンシングに使用される第3世代^{[ 1 ]}アプローチです。

ナノポアシーケンシングでは、 PCR増幅や化学標識なしで、DNAまたはRNAの単一分子の配列決定が可能です。ナノポアシーケンシングは、比較的低コストの遺伝子型判定、検査のための高い移動性、リアルタイムの結果表示機能を含むサンプルの迅速な処理を提供する可能性を秘めています。ウイルス病原体の迅速な同定^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}、エボラの モニタリング^{[ 5 ]}、環境モニタリング^{[ 6 ]} 、食品安全モニタリング、ヒトゲノムシーケンシング^{[ 7 ]} 、植物ゲノムシーケンシング^{[ 8 ]} 、抗生物質耐性のモニタリング^{[ 9 ]}、ハプロタイピング^{[ 10 ]}、その他の用途に提案されています。

ナノポアシーケンシングが実現するまでには25年の歳月を要した。デイビッド・ディーマーはそのアイデアを最初に提唱した人物の一人である。1989年、彼はRNA合成の研究の一環として、薄い膜に埋め込まれたタンパク質ナノポアを通してDNAの一本鎖を通過させる計画を概説した。この手法がDNAシーケンシングを可能にするかもしれないと気づいたディーマーと彼のチームは、10年かけてこの概念を改良した。1999年、彼らは「ナノポアシーケンシング」という用語を用いた最初の論文を発表し、2年後にはDNAヘアピンがナノポアを通過する様子をリアルタイムで捉えた画像を公開した。

ナノポアシーケンシングのもう一つの基礎は、 1990年代から独自に確率的センシングを開発したヘイガン・ベイリーのチームの研究である。この技術は、ナノポアを通過するイオン電流の変化を測定して物質の濃度と種類を決定するものである。2005年までにベイリーはDNAシーケンシング法で進歩を遂げた。彼はこの技術を推進するためにオックスフォード・ナノポアを共同設立した。2014年、同社は最初のポータブルナノポアシーケンシング装置を発売した。これにより、限られたリソースでもほぼどこでもDNAシーケンシングを実行できるようになった。世界のSA​​RS-CoV-2ウイルスゲノムの4分の1がナノポア装置でシーケンスされた。この技術は抗菌薬耐性と戦うための重要なツールを提供する。^{[ 11 ]}

ナノポアが存在する生物学的または固体状態の膜は、電解質溶液に囲まれています。^{[ 12 ]}この膜は溶液を2つのチャンバーに分割します。^{[ 13 ]}膜にバイアス電圧を印加すると、電場が発生し、この場合はイオンである荷電粒子が動きます。この効果は電気泳動として知られています。濃度が十分に高い場合、電解質溶液は均一に分布し、電圧降下はナノポアの近くと内部に集中します。つまり、溶液中の荷電粒子は、ポア領域の近くにいるときのみ電場からの力を感じます。^{[ 14 ]}この領域は通常、捕捉領域と呼ばれます。捕捉領域内では、イオンは方向性のある動きをし、膜の近くに電極を配置することで、定常イオン電流として記録できます。チャンバーの1つに配置されたDNAやタンパク質などのナノサイズのポリマーは、捕捉領域の電場から力を感じる正味の電荷を持ちます。^{[ 14 ]}分子はブラウン運動によってこの捕捉領域に近づきます。膜の表面に対する引力は、^{[ 14 ]}ナノポア内に入ると、分子は電気泳動力、電気浸透力、場合によっては熱泳動力の組み合わせによって移動します。^{[ 12 ]}ポア内では、分子はイオンの流れを部分的に制限する体積を占め、イオン電流の低下として観測されます。形状、サイズ、化学組成などのさまざまな要因に基づいて、イオン電流の大きさの変化と移動の持続時間は異なります。この電流変調に基づいて、さまざまな分子を検出して識別することができます。^{[ 15 ]}

ナノポアデバイスは、環境モニタリング^{[ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]}や作物疫学^{[ 41 ]}におけるeDNA分析に使用できます。これらは以前の技術よりも小型化できるため、特にMinIONなどの携帯型デバイスになっています。^{[ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]} MinIONは、Boykinら2018年およびShaffer2019年^{[ 41 ]}による作物ウイルスの研究、およびMenegonら2017年^{[ 41 ] [ 42 ]}およびPomerantzら2018年^{[ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]}による種の蔓延の研究で特に知られています。携帯性が高く、低コストで、迅速なシーケンスアプリケーションに使いやすいことから、他の次世代シーケンス技術と同様に、倫理的、法的、社会的な懸念も生じています^{[ 44 ]}。^{[ 45 ]プラハの廃水中のSARS-CoV-2変異株は、ナノポアベースのシーケンスによって検出されました。下水流域の小サンプルのシーケンスは、}疫学的早期警戒システムに役立ちます。^{[ 46 ]}

適応型サンプリングは、ナノポアシーケンスに適用して単一の遺伝子を標的にしたり濃縮したりすることができ、全ゲノムシーケンスに伴う非効率性とコストを削減します。機能的には、適応型ナノポアシーケンスは、ナノポアシーケンスと同じメカニズムで進行します。そこでは、一本鎖ポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）がシーケンス膜のポアを通過し、電流の特性変化を使用して各塩基を識別できます。適応型サンプリングでは、電気信号がリアルタイムで使用され、ゲノムが解読され、シーケンスを続けるかどうかが決定されます。シーケンスが関心のないものであれば、膜電位が反転され、鎖は破棄されます。ライブリードの計算処理は、約450 nt/sの速度で進行するナノポアシーケンスよりも速くなければならず、意思決定に十分な時間を確保する必要があります。  ^{[ 47 ]}

適応型サンプリングの主なモードは、濃縮と枯渇の 2 つです。濃縮モードでは、関心領域 (ROI) が指定されます。各ストランドは、「読み取り完了」決定フェーズでシーケンスされます。その後、ROI がシーケンス内で特定されなかった場合、ストランドは拒否されます。一方、枯渇モードでは、関心のないターゲットが選択され、ヒットすると拒否されます。これにより、汚染物質のシーケンスにかかるコストと労力が削減され、マイクロバイオームメタゲノム解析の改善の機会が開かれます。ナノポアシーケンスデバイスは、リアルタイムで DNA ストランドを選択的に排出できるため、ターゲットシーケンスへの完全な計算アプローチが可能になります。^{[ 48 ]}

「ストランドシーケンシング」法の課題の一つは、単一塩基を検出できるように解像度を向上させるために方法を改良することでした。初期の論文の方法では、測定可能な特徴的な変化を生み出すために、ヌクレオチドを配列中で約100回連続して繰り返す必要がありました。この解像度の低さは、DNA鎖がナノポアを1塩基あたり1～5μsの速度で高速で移動するためです。これにより記録が困難になり、バックグラウンドノイズが発生しやすくなり、単一ヌクレオチドの解像度を得ることができませんでした。2006年現在、この問題は、記録技術を改善するか、さまざまなタンパク質工学戦略によってDNA鎖の速度を制御することによって解決されており、オックスフォードナノポアは「kmerアプローチ」を採用し、一度に複数の塩基を分析することで、DNA鎖がナノポアを一度に1塩基ずつ通過するにつれて、DNAの断片が繰り返し検査されるようになっています。^{[ 53 ]} MinIONテクノロジーが初めてユーザーに提供されて以来、アルゴリズムを含むさまざまな技術が、その性能を向上させるために使用されてきました。^{[ 54 ]}最近では、二次構造や遊離したモノヌクレオチドによる単一塩基の影響が示されています。^{[ 55 ] [ 56 ]}

2010年にHagan Bayleyは、 α-ヘモリシンポア内に2つの認識部位を作ることで、塩基認識に利点がもたらされる可能性があると提唱した。^{[ 23 ]}

2009年現在、「エキソヌクレアーゼアプローチ」^{[ 57 ]}（プロセス酵素が個々の塩基を正しい順序でナノポアに供給する）の課題の1つは、エキソヌクレアーゼとナノポア検出システムを統合することである。特に、^{[ 58 ]}問題は、エキソヌクレアーゼがDNA中のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解すると、その後に放出されたヌクレオチドが、例えば近くのαヘモリシンナノポアに直接移動することが必ずしも保証されないことである。2009年には、おそらくβバレルヘモリシンへのビオチン化を介して、エキソヌクレアーゼをナノポアに結合させるというアイデアがあった。^{[ 58 ]}

タンパク質の中心孔は、正電荷と負電荷が孔の両側に現れるように配置された荷電残基で覆われている可能性がある。しかし、このメカニズムは主に選択的なものであり、ヌクレオチドを特定の経路に導くメカニズムではない。