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| DNAリガーゼ | |||||||||
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 染色体の損傷を修復する DNA リガーゼの想像図 | |||||||||
| 識別子 | |||||||||
| EC番号 | 6.5.1.1 | ||||||||
| CAS番号 | 9015-85-4 | ||||||||
| データベース | |||||||||
| インテンズ | IntEnzビュー | ||||||||
| ブレンダ | BRENDAエントリー | ||||||||
| エクスパス | NiceZyme ビュー | ||||||||
| ケッグ | KEGGエントリー | ||||||||
| メタサイク | 代謝経路 | ||||||||
| プリアモス | プロフィール | ||||||||
| PDB構造 | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| 遺伝子オントロジー | アミゴー / クイックゴー | ||||||||
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| リガーゼ I、DNA、ATP 依存性 | |||||||
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| 識別子 | |||||||
| シンボル | LIG1 | ||||||
| NCBI遺伝子 | 3978 | ||||||
| HGNC | 6598 | ||||||
| オミム | 126391 | ||||||
| 参照シーケンス | NM_000234 | ||||||
| ユニプロット | P18858 | ||||||
| その他のデータ | |||||||
| 軌跡 | 第19章 [1] | ||||||
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| リガーゼIII、DNA、ATP依存性 | |||||||
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| 識別子 | |||||||
| シンボル | LIG3 | ||||||
| NCBI遺伝子 | 3980 | ||||||
| HGNC | 6600 | ||||||
| オミム | 600940 | ||||||
| 参照シーケンス | NM_002311 | ||||||
| ユニプロット | P49916 | ||||||
| その他のデータ | |||||||
| 軌跡 | 第17章 q11.2-q12 | ||||||
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DNAリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することでDNA鎖の結合を促進する酵素の一種です。生体内の二重鎖DNAの一本鎖切断を修復する役割を果たしますが、一部の形態（ DNAリガーゼIVなど）は特に二重鎖切断（つまり、DNAの両方の相補鎖の切断）を修復する場合があります。一本鎖切断は、二重らせんの相補鎖をテンプレートとして使用してDNAリガーゼによって修復され、[1] DNAリガーゼは最終的なホスホジエステル結合を形成してDNAを完全に修復します。
DNA リガーゼは、 DNA 修復とDNA 複製の両方に使用されます(哺乳類リガーゼを参照)。さらに、DNA リガーゼは分子生物学研究室で組み換え DNA実験に広く使用されています (研究アプリケーションを参照)。精製された DNA リガーゼは、遺伝子クローニングで DNA 分子を結合して組み換え DNA を形成するために使用されます。
酵素のメカニズム
DNA リガーゼのメカニズムは、 1 つのヌクレオチド(「アクセプター」)の3' ヒドロキシル末端と、もう 1 つのヌクレオチド (「ドナー」) の5' リン酸末端との間に2 つの共有 ホスホジエステル結合を形成することです。形成されるホスホジエステル結合ごとに 2 つの ATP 分子が消費されます。[要出典]リガーゼ反応には AMP が必要であり、次の 4 つのステップで進行します。
- DNAセグメントの切れ目や岡崎フラグメントなどの活動部位の再編成。
- 酵素の活性中心のリジン残基のアデニル化（AMP の付加）により、ピロリン酸が放出されます。
- AMP をいわゆるドナーの 5' リン酸に転移し、ピロリン酸結合を形成します。
- ドナーの5'リン酸とアクセプターの3'ヒドロキシルの間にホスホジエステル結合が形成される。[2]
リガーゼは平滑末端でも機能しますが、より高い酵素濃度と異なる反応条件が必要になります。
種類
大腸菌
大腸菌DNAリガーゼはlig遺伝子によってコード化されている。大腸菌のDNAリガーゼは、ほとんどの原核生物と同様に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）を切断して得たエネルギーを利用してリン酸ジエステル結合を形成する。[3]ポリエチレングリコール による分子密集状態以外では、平滑末端DNAを連結することはなく、RNAをDNAに効率的に結合することもできない。[要出典]
大腸菌DNAリガーゼの活性は、適切な濃度のDNAポリメラーゼによって増強される。増強は、DNAポリメラーゼ1の濃度が連結されるDNA断片よりもはるかに低い場合にのみ機能する。Pol I DNAポリメラーゼの濃度が高いと、大腸菌DNAリガーゼに悪影響を与える[4]
T4
バクテリオファージT4（大腸菌に感染するバクテリオファージ）由来のDNAリガーゼ。T4リガーゼは研究室で最も一般的に使用されています。[5] DNA、オリゴヌクレオチド、RNA、RNA-DNAハイブリッドの付着末端または平滑末端 を連結できますが、一本鎖核酸は連結できません。また、大腸菌DNAリガーゼよりもはるかに高い効率で平滑末端DNAを連結できます。大腸菌DNAリガーゼとは異なり、T4 DNAリガーゼはNADを利用できず、補因子としてATPが絶対必要です。T4 DNAリガーゼのin vitro活性を向上させるためにいくつかのエンジニアリングが行われてきました。例えば、1つの成功したアプローチでは、いくつかの代替DNA結合タンパク質と融合したT4 DNAリガーゼをテストし、融合パートナーとしてp50またはNF-kBのいずれかを含むコンストラクトは、野生型T4 DNAリガーゼよりもクローニング目的の平滑末端ライゲーションで160％以上活性が高いことを発見しました。 [6] プラスミドベクターにフラグメントを挿入するための典型的な反応では、約0.01（粘着末端）から1（平滑末端）単位のリガーゼを使用します。T4 DNAリガーゼの最適なインキュベーション温度は16℃です。[要出典]
バクテリオファージT4リガーゼ変異体は紫外線照射[7] [8]とアルキル化剤メチルメタンスルホン酸[9]の両方に対する感受性が高まっており、DNAリガーゼがこれらの薬剤によって引き起こされるDNA損傷の修復に利用されていることを示している。
哺乳類
哺乳類には、4 つの特定のタイプのリガーゼが存在します。
- DNAリガーゼ1 :リボヌクレアーゼHが岡崎断片からRNAプライマーを除去した後、ラギング鎖の新生DNAを連結します。
- DNA リガーゼ 3 : DNA 修復タンパク質XRCC1と複合体を形成し、ヌクレオチド除去修復および組み換え断片のプロセス中に DNA を密封するのに役立ちます。既知のすべての哺乳類 DNA リガーゼのうち、リガーゼ 3 のみがミトコンドリアに存在することがわかっています。
- DNAリガーゼ4：XRCC4と複合体を形成します。非相同末端結合DNA二本鎖切断修復経路の最終段階を触媒します。また、免疫システムの発達中に免疫グロブリンとT細胞受容体遺伝子座に多様性を生み出すプロセスであるV(D)J組換えにも必要です。
- DNAリガーゼ2：DNAリガーゼ3のタンパク質分解によって生じる精製産物。当初は別のDNAリガーゼとして認識されており、DNAリガーゼの珍しい命名法の理由となっている。[10]
真核生物や一部の微生物のDNAリガーゼはNADではなくアデノシン三リン酸（ATP）を使用します。 [3]
耐熱性
好熱性細菌由来のこの酵素は、従来の DNA リガーゼよりもはるかに高い温度でも安定して活性を示します。半減期は 65 °C で 48 時間、95 °C で 1 時間以上です。アンプリガーゼ DNA リガーゼは、少なくとも 500 回の熱サイクル (94 °C/80 °C) または 16 時間のサイクルで活性であることが示されています。10この 並外れた熱安定性により、非常に高いハイブリダイゼーションの厳密性とライゲーションの特異性が可能になります。[11]
活動の測定
DNAリガーゼの活性を測定するために使用される単位は少なくとも3つあります。[12]
- ワイス単位- 37 ° Cで 20 分間に1 nmole の32 P を無機ピロリン酸から ATP に交換する反応を触媒するリガーゼの量。これは最も一般的に使用される単位です。
- Modrich-Lehman 単位- これはめったに使用されませんが、1 単位は、標準条件下で 30 分以内に 100 nmole の d(AT) n をエキソヌクレアーゼ III 耐性形態に変換するのに必要な酵素の量として定義されます。
- 多くの市販のリガーゼ供給業者は、リガーゼが結合末端を連結する能力に基づいて任意の単位を使用しています。これらの単位は定量的というより主観的であることが多く、精度に欠けます。
研究アプリケーション
DNA リガーゼは、組み換え DNA配列を生成するための現代の分子生物学研究に欠かせないツールとなっています。たとえば、DNA リガーゼは制限酵素とともに使用され、多くの場合は遺伝子である DNA 断片をプラスミドに挿入します。
最適温度を制御することは、付着末端断片のライゲーションを伴う効率的な組換え実験を行う上で極めて重要な側面である。ほとんどの実験では、37 °Cで最も活性となるT4 DNAリガーゼ（バクテリオファージT4から単離）が使用される。 [13] しかし、付着末端断片（「粘着末端」）とのライゲーション効率を最適化するには、最適な酵素温度が、ライゲーションされる粘着末端の融解温度T mとバランスをとる必要がある。 [14]高温により水素結合が破壊されるため、粘着末端の相同対合は安定しない。ライゲーション反応は、粘着末端がすでに安定してアニールされている場合に最も効率的であり、アニール末端が破壊されるとライゲーション効率が低下する。オーバーハングが短いほど、T mは低くなる。
平滑末端 DNA 断片にはアニールする付着末端がないため、ライゲーション反応の通常の温度範囲内では融解温度は考慮すべき要素ではありません。平滑末端ライゲーションの制限要因はリガーゼの活性ではなく、DNA 断片末端間のアラインメントの数です。したがって、平滑末端 DNA の最も効率的なライゲーション温度は、最大数のアラインメントが発生できる温度になります。平滑末端ライゲーションの大部分は、14～25 °C で一晩行われます。安定してアニールされた末端が存在しないということは、ライゲーション効率が低下することを意味し、より高いリガーゼ濃度を使用する必要があります。[14]
DNAリガーゼの新たな用途は、ナノ化学、特にDNA折り紙の分野で見られる。DNAベースの自己組織化原理は、生体分子、ナノマシン、ナノエレクトロニクスおよびフォトニックコンポーネントなどのナノスケールの物体を組織化するために有用であることが証明されている。このようなナノ構造を組み立てるには、DNA分子の複雑なメッシュを作成する必要がある。DNAの自己組織化は、アルミホイルの緊張性表面の提供などのさまざまな基板を使用して外部からの支援なしに可能であるが、DNAリガーゼは、DNAオーバーハングからDNA格子構造を作成するために必要な酵素支援を提供することができる。[15]
歴史
最初の DNA リガーゼは、1967 年にゲラート、レーマン、リチャードソン、ハーウィッツの各研究所で精製され、特性が明らかにされました。[16]これは、細胞残骸の除去とストレプトマイシンの添加から始まり、ジエチルアミノエチル (DEAE) セルロースカラムで数回洗浄し、最後にホスホセルロース分画を行う 6 段階のクロマトグラフィー分画プロセスを使用して、ワイスとリチャードソンによって初めて精製され、特性が明らかにされました。最終抽出物 には、大腸菌 培地で最初に記録された活性の 10% が含まれていました。このプロセスで、反応を最適化するには ATP と Mg++ が必要であることが発見されました。一般的に市販されている DNA リガーゼは、もともとバクテリオファージ T4、大腸菌、その他の細菌で発見されました。[17]
障害
ヒトDNAリガーゼの遺伝子欠損は、免疫不全、放射線感受性、発達異常を特徴とする臨床症候群と関連している。 [16] LIG4症候群（リガーゼIV症候群）は、DNAリガーゼ4の変異に関連する稀な疾患であり、dsDNA切断修復機構を阻害する。リガーゼIV症候群は、個人に免疫不全を引き起こし、一般的に小頭症および骨髄低形成と関連している。[18] DNAリガーゼの欠損または機能不全によって引き起こされる一般的な疾患のリストは以下のとおりである。
色素性乾皮症
色素性乾皮症（XP）は、日光の紫外線（UV）に対する極度の敏感さを特徴とする遺伝性疾患です。この疾患は主に目と日光にさらされる皮膚の部分に発症します。罹患した人の中には神経系に問題を抱える人もいます。[19]
毛細血管拡張性運動失調症
ATM 遺伝子の変異は、 毛細血管拡張性運動失調症を引き起こす。ATM 遺伝子は、細胞分裂の制御を助け、DNA 修復に関与するタンパク質を作るための指示を提供する。このタンパク質は、神経系や免疫系を含むいくつかの身体系の正常な発達と活動において重要な役割を果たしている。ATM タンパク質は、細胞が損傷または破損した DNA 鎖を認識するのを助け、破損した鎖を修復する酵素を活性化することで DNA 修復を調整する。損傷した DNA 鎖を効率的に修復することで、細胞の遺伝情報の安定性を維持するのに役立つ。罹患した子供は通常、歩行困難、バランスと手の協調の問題、不随意のけいれん運動 (舞踏病)、筋肉のけいれん (ミオクローヌス)、神経機能障害 (神経障害) を発症する。運動障害により、通常、思春期までに車椅子の介助が必要になる。この障害を持つ人は、ろれつが回らず、目を左右に動かすのに困難がある (眼球運動失行症)。[20]
ファンコニ貧血
ファンコニ貧血（FA）は、骨髄不全を引き起こすまれな遺伝性血液疾患です。FAは、体が正常に機能するために必要な新しい血液細胞を骨髄が十分に生成するのを妨げます。また、FAは骨髄に多くの欠陥のある血液細胞を生成する原因にもなります。これは、白血病などの深刻な健康問題につながる可能性があります。[21]
ブルーム症候群
ブルーム症候群は、日光に敏感な皮膚を引き起こし、通常は鼻と頬に蝶形の赤くなった皮膚の斑点が現れます。また、手の甲や前腕など、日光によくさらされる他の部位にも皮膚の発疹が現れることがあります。発疹には、拡張した血管の小さな塊 (毛細血管拡張症) がよく現れます。毛細血管拡張症は目にも発生することがあります。その他の皮膚の特徴として、周囲の部位よりも明るい部分や暗い部分の皮膚 (それぞれ色素減少症または色素過剰症) があります。これらの斑点は、日光にさらされていない皮膚の部位に現れ、その発生は発疹とは関係ありません。
薬物ターゲットとして
最近の研究では、ヒトDNAリガーゼIがコンピュータ支援薬物設計に使用され、癌の治療薬として可能性のあるDNAリガーゼ阻害剤が特定されました。[22]過剰な細胞増殖は癌の発症の特徴であるため、DNAリガーゼの機能を破壊する標的化学療法は、補助癌の形態を阻害することができます。さらに、DNAリガーゼは、ATP依存性とNAD +依存性の2つのカテゴリに大まかに分類できることが示されています。以前の研究では、NAD +依存性DNAリガーゼは細菌の生命ドメイン外の散発的な細胞またはウイルスニッチで発見されていますが、真核生物にNAD +依存性リガーゼが存在する例はありません。非真核生物にのみ存在し、独特の基質特異性があり、ATP依存性のヒトDNAリガーゼと比較してNAD +依存性リガーゼの独特のドメイン構造は、NAD +依存性リガーゼを新しい抗菌薬の開発の理想的なターゲットにします。[16]
参照
参考文献
- ^ Pascal JM、O'Brien PJ、 Tomkinson AE、 Ellenberger T (2004 年 11 月)。「ヒト DNA リガーゼ I はニック DNA を完全に取り囲み、部分的に巻き戻す」。Nature . 432 ( 7016 ) : 473–8。Bibcode :2004Natur.432..473P。doi :10.1038/nature03082。PMID 15565146。S2CID 3105417。
- ^ Lehman IR (1974年11月). 「DNAリガーゼ：構造、メカニズム、機能」. Science . 186 (4166): 790–7. Bibcode :1974Sci...186..790L. doi :10.1126/science.186.4166.790. PMID 4377758. S2CID 86549159.
- ^ ab Foster JB、Slonczewski J (2010)。『微生物学：進化する科学（第2版）』。ニューヨーク：WW Norton & Company。ISBN 978-0-393-93447-2。
- ^ Yang Y、LiCata VJ (2018年2月)。「Pol I DNAポリメラーゼは大腸菌DNAリガーゼによるDNA末端結合を刺激する」。生化学 および生物物理学的研究通信。497 (1):13–18。doi : 10.1016/ j.bbrc.2018.01.165。PMID 29409896。
- ^ 「リガーゼ」（PDF）。酵素リソースガイド。Promega Corporation。pp. 8～14。
- ^ Wilson RH、Morton SK、Deiderick H、Gerth ML、Paul HA、Gerber I、Patel A、Ellington AD、Hunicke-Smith SP、Patrick WM (2013 年 7 月)。「in vitro での活性が向上した改変 DNA リガーゼ」。タンパク質工学、設計、選択。26 (7): 471–8。doi : 10.1093/protein/ gzt024。PMID 23754529 。
- ^ Baldy MW ( 1968). 「ファージT4の修復と組み換え。II. UV感受性に影響を与える遺伝子」。Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology。33 : 333–8。doi :10.1101/sqb.1968.033.01.038。PMID 4891973 。
- ^ Baldy MW (1970年2月). 「ファージT4の初期機能温度感受性変異体のUV感受性」.ウイルス学. 40 (2): 272–87. doi :10.1016/0042-6822(70)90403-4. PMID 4909413.
- ^ Baldy MW、Strom B、Bernstein H (1971 年 3 月)。「ポリヌクレオチドリガーゼを 介したメカニズムによるアルキル化バクテリオファージ T4 デオキシリボ核酸の修復」。Journal of Virology。7 ( 3): 407–8。doi : 10.1128 / JVI.7.3.407-408.1971。PMC 356131。PMID 4927528。
- ^ Tomkinson, Alan E; Sallmyr, Annahita (2013年9月5日). 「哺乳類LIG3遺伝子によってコードされるDNAリガーゼの構造と機能」. Gene . 531 (2): 150–157. doi :10.1016/j.gene.2013.08.061. PMC 3881560. PMID 24013086 .
- ^ 「AmpliGase- 耐熱性DNAリガーゼ」www.epibio.com。2017年6月19日時点のオリジナルよりアーカイブ。2017年5月15日閲覧。
- ^ Russell DW、Sambrook J (2001)。「第 1 章: プラスミドと分子クローニングにおけるその有用性」。分子クローニング: 実験マニュアル。第 1 巻 (第 3 版)。コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク: コールド スプリング ハーバー研究所。pp. 1–159。ISBN 978-0-87969-577-4。
- ^ Baneyx F, Lucotte G (1993).分子クローニング技術入門. チチェスター: John Wiley & Sons. p. 156. ISBN 978-0-471-18849-0。
- ^ ab Tabor S (2001 年 5 月). 「DNA リガーゼ」.分子生物学の最新プロトコル. 第 3 章: ユニット 3.14. doi :10.1002/0471142727.mb0314s08. ISBN 978-0-471-14272-0. PMID 18265223. S2CID 23944826.
- ^ Bhanjadeo MM、Nayak AK、 Subudhi U (2017)。「表面支援DNA自己組織化：分岐DNA格子の形成に向けた酵素フリー戦略」。生化学および生物物理学的研究通信。485 （2）：492–498。doi ：10.1016/ j.bbrc.2017.02.024。PMID 28189681 。
- ^ abc Shuman S (2009年6月). 「DNAリガーゼ：進歩と展望」. The Journal of Biological Chemistry . 284 (26): 17365–9. doi : 10.1074/jbc.R900017200 . PMC 2719376. PMID 19329793 .
- ^ Weiss B、Richardson CC (1967 年 4 月)。「デオキシリボ核酸の酵素的切断と結合、I。T4 バクテリオファージに感染した大腸菌の酵素システムによる DNA の一本鎖切断の修復」。米国科学アカデミー紀要。57 (4): 1021–8。Bibcode : 1967PNAS ... 57.1 021W。doi : 10.1073/ pnas.57.4.1021。PMC 224649。PMID 5340583 。
- ^ Altmann T, Gennery AR (2016年10月). 「DNAリガーゼIV症候群; レビュー」. Orphanet Journal of Rare Diseases . 11 (1): 137. doi : 10.1186 /s13023-016-0520-1 . PMC 5055698. PMID 27717373.
- ^ 「色素性乾皮症」。遺伝学ホームリファレンス。2017年5月15日閲覧。
- ^ 「毛細血管拡張性運動失調症」。遺伝学ホームリファレンス。2017年5月15日閲覧。
- ^ 「ファンコニ貧血とは？」NHLBI、NIH 。2017年5月15日閲覧。
- ^ Tomkinson AE、Howes TR、Wiest NE (2013年6月)。「治療標的としてのDNAリガーゼ」。トランスレーショナル・キャンサー・リサーチ 。2 ( 3 ) 。PMC 3819426。PMID 24224145。
