透過型電子顕微鏡によるDNAシーケンシング

標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と同様に、配列決定を行う二本鎖DNA分子は、標識ヌクレオチドを用いて第二鎖を合成する前に変性させる必要がある。

生体分子を構成する元素（C、H、N、O、P、S ）は原子番号（Z）が小さいため、透過型電子顕微鏡では個々の原子として明確に観察することができません。この問題を回避するため、DNA塩基に原子番号の大きい原子を標識として用いることができます。各ヌクレオチドはそれぞれ特徴的な重い標識で標識されるため、透過型電子顕微鏡画像上で区別することが可能になります。

• ZS Genetics社は、臭素（Z=35）、ヨウ素（Z=53）、トリクロロメタン（合計Z=63）という3種類の重標識を用いることを提案している。これらは顕微鏡写真上で濃淡の異なる斑点として現れ、4番目のDNA塩基は標識されないままとなる。
• Halcyon Molecularは、Tosteグループとの共同研究により、プリン塩基とピリミジン塩基をそれぞれ白金ジアミンまたは四酸化オスミウムビピリジンで官能基化できると提案している。オスミウム（Z=76）、イリジウム（Z=77）、金（ Z=79）、ウラン（Z=92）などの重金属原子は、これらの官能基と金属-金属結合を形成して、個々の塩基を標識することができる。^{[ 12 ]}

DNA分子は薄い固体​​基板上に引き伸ばされていなければならず、そうすることで標識された塩基の順序が電子顕微鏡写真上で明確に見えるようになる。分子コーミングは、後退する空気と水の界面の力を利用してDNA分子を引き伸ばし、乾燥するとシラン層に不可逆的に結合させる技術である。^{[ 13 ] [ 14 ]}これは、固体基板上でDNAを整列させる方法の1つである。

透過型電子顕微鏡（TEM）は、非常に薄い試料に電子ビームを通すことで、高倍率、高解像度の画像を生成します。従来のTEMでは原子分解能が実証されていますが、空間分解能をさらに向上させるには、顕微鏡レンズの球面収差と色収差を補正する必要があります。これは、陰極線管と同様の方法で、細かく集束された電子ビームで対象物を走査して画像を取得する走査透過型電子顕微鏡でのみ可能でした。しかし、達成された分解能の向上は、研究対象物へのはるかに高いビーム強度の照射、それに伴う試料の損傷、および関連する画像アーティファクトを伴います。^{[ 15 ]}試料が重原子を含むか軽原子を含むかに応じて、異なる画像化技術が適用されます。

• 環状暗視野イメージングは​​、透過型電子顕微鏡サンプル中の原子核から電子が逸れる際の散乱を測定する。^{[ 5 ]}これは、電子の散乱をより多く引き起こす重原子を含むサンプルに最適である。この技術は、ホウ素、窒素、炭素などの軽い原子のイメージングに使用されてきたが、^{[ 5 ]}このような軽い原子では信号が非常に弱い。環状暗視野顕微鏡法を透過型電子顕微鏡によるDNAシーケンスに適用する場合、強い信号を検出できるように、DNA塩基を重原子で標識する必要があることは間違いない。
• 環状明視野イメージングは​​、試料を直接透過した電子を検出し、原子核との相互作用によって生じる波の干渉を測定します。この技術は、環状暗視野イメージング法よりも高い感度で軽原子を検出できます。実際、結晶固体中の酸素^{[ 16 ]} 、窒素^{[ 16 ]} 、リチウム^{[ 17 ]}、水素^{[ 18 ]}は、環状明視野電子顕微鏡を使用してイメージングされています。したがって、理論的にはDNA鎖中の原子の直接イメージングを取得できますが、DNAの構造は結晶固体よりもはるかに幾何学的ではないため、事前の標識なしでの直接イメージングは​​実現できない可能性があります。

電子顕微鏡写真上の暗い部分と明るい部分は、異なる標識が施されたDNA塩基に対応しており、コンピュータソフトウェアによって解析される。

ゲノムをシーケンスする場合、1回の読み取りでシーケンスできるほど短い断片に分割する必要があります。これらのリードは、リード間の重複領域をアラインメントすることで、ジグソーパズルのように組み立て直されます。このプロセスは、de novoゲノムアセンブリと呼ばれます。シーケンスプラットフォームが提供するリード長が長いほど、重複領域が長くなり、ゲノムのアセンブリが容易になります。計算の観点から見ると、参照ゲノム配列が存在しないゲノムのシーケンスとアセンブリには、マイクロ流体サンガーシーケンスが依然として最も効果的な方法です。比較的長いリード長により、個々のシーケンスリード間に大きな重複が生じ、アセンブリの統計的信頼性が高まります。さらに、長いサンガーリードは、誤ったアラインメントを引き起こしてシーケンスアセンブリを混乱させる反復DNA配列のほとんどの領域を網羅することができます。しかし、サンガーシーケンスによるde novoゲノムアセンブリは、非常に高価で時間がかかります。第二世代シーケンシング技術^{[ 19 ]}は、コストは低いものの、リード長が短いため、一般的に新規ゲノムアセンブリには適していません。一般的に、透過型電子顕微鏡DNAシーケンシングを含む第三世代シーケンシング技術^{[ 11 ]}は、シーケンシングコストを低く抑えながらリード長を向上させることを目的としています。したがって、第三世代シーケンシング技術が向上するにつれて、迅速かつ安価な新規ゲノムアセンブリが現実のものとなるでしょう。

ハプロタイプとは、単一の染色体上で一緒に遺伝する一連の連鎖した対立遺伝子のことです。DNAシーケンスは、ハプロタイプを構成するすべての単一ヌクレオチド多型（SNP）の遺伝子型を決定するために使用できます。しかし、短いDNAシーケンスリードではフェージングができない場合が多く、つまり、ヘテロ接合型変異を正しいハプロタイプに確実に割り当てることができません。実際、短いリードのDNAシーケンスデータでハプロタイピングを行うには、SNPを正確に識別するために非常に高いカバレッジ（各DNA塩基の平均50倍以上のカバレッジ）が必要であり、メンデル遺伝を使用してハプロタイプを推定できるように、両親からの追加シーケンスデータも必要です。^{[ 20 ]}透過型電子顕微鏡DNAシーケンスなど、長いリードを生成するシーケンス技術では、1つのリードでハプロブロック全体をキャプチャできます。つまり、ハプロタイプは複数のリードに分割されず、遺伝的に連鎖した対立遺伝子はシーケンスデータ内で一緒に残ります。したがって、ロングリードはハプロタイピングをより簡単かつ正確にするため、集団遺伝学の分野にとって有益である。

遺伝子は通常、二倍体ヒトゲノムに2コピー存在します。この標準的なコピー数から逸脱する遺伝子は、コピー数変異（CNV）と呼ばれます。コピー数変異は良性（これらは通常、コピー数多型と呼ばれる一般的な変異です）または病原性です。^{[ 21 ]} CNVは、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）または比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）によって検出されます。欠失が発生する特定のブレークポイントを検出するため、または重複または増幅イベントによって導入されたゲノム病変を検出するために、タイリングアレイ（アレイCGH）を使用してCGHを実行するか、変異領域をシーケンスすることができます。長いシーケンスリードは、重複または増幅の分析に特に役立ちます。これは、増幅されたセグメントが単一のシーケンスリードで捕捉されている場合、増幅されたセグメントの向きを分析できるためです。

がんゲノム学、または腫瘍ゲノム学は、ハイスループットの第2世代DNAシーケンス技術をがんゲノム全体のシーケンスに適用する新興分野です。このショートリードシーケンスデータの解析には、ショートリードデータを使用したde novoゲノムアセンブリに関連するすべての問題が含まれます。^{[ 22 ]}さらに、がんゲノムはしばしば異数体です。^{[ 23 ]}本質的に大規模なコピー数変異であるこれらの異常は、リード頻度を使用してコピー数を推定する第2世代シーケンス技術によって解析できます。^{[ 22 ]}ただし、より長いリードは、がんゲノムに存在するコピー数、増幅領域の向き、およびSNPのより正確な像を提供します。

マイクロバイオームとは、微小環境に存在する微生物の総体と、それぞれのゲノムを指します。例えば、人間の体内には常に推定100兆個の微生物細胞が生息しています。^{[ 24 ]}人間のマイクロバイオームは、これらの共生細菌が人間の健康と免疫にとって重要であるため、特に注目されています。地球上の細菌ゲノムのほとんどはまだ配列決定されていません。マイクロバイオームのシーケンスプロジェクトを実施するには、大規模なde novoゲノムアセンブリが必要になりますが、これは短いリードのDNAシーケンス技術では困難な見込みです。^{[ 25 ]}長いリードがあれば、新しい微生物ゲノムのアセンブリが大幅に容易になります。

• より長いリード長：ZS Geneticsは、透過型電子顕微鏡DNAシーケンスの潜在的なリード長を10,000～20,000塩基対、1日あたり17億塩基対の速度と推定している。^{[ 7 ]}このような長いリード長により、de novoゲノムアセンブリやハプロタイプの直接検出などが容易になる。 ^{[ 11 ]}
• 低コスト：透過型電子顕微鏡によるDNAシーケンスは、より高価な第2世代DNAシーケンスの代替手段と比較して、ヒトゲノムあたりわずか5,000～10,000米ドルと推定されています。^{[ 10 ]}
• 位相ずれなし：合成中の同期性の喪失によるDNA鎖の位相ずれは、第2世代シーケンシング技術の大きな問題です。透過型電子顕微鏡DNAシーケンシングやその他の第3世代シーケンシング技術では、一度に1つの分子しか読み取られないため、リードの同期は不要です。^{[ 7 ] [ 11 ]}
• 処理時間の短縮：DNAのネイティブな断片を読み取る能力により、全ゲノムシーケンスの一般的なワークフローにおいて、複雑なテンプレートの準備が不要なステップとなります。その結果、処理時間を短縮することが可能になります。^{[ 11 ]}

• 高額な設備投資：透過型電子顕微鏡によるDNAシーケンスに必要な十分な解像度を備えた透過型電子顕微鏡は約100万米ドルかかるため、この方法でDNAシーケンスを行うには多額の投資が必要となる。^{[ 10 ]}
• 技術的に困難：選択的な重原子標識、標識されたDNAを基板に付着させてまっすぐにすることは、深刻な技術的課題である。^{[ 10 ]}さらに、DNAサンプルは電子顕微鏡の高真空と高エネルギー電子の集束ビームによる照射に対して安定している必要がある。
• PCRの潜在的なバイアスとアーティファクト：PCRは透過型電子顕微鏡DNAシーケンスにおいて、DNA鎖を重原子または金属で標識する手段としてのみ利用されているが、テンプレート表現にバイアスが生じたり、単一増幅中にエラーが発生したりする可能性がある。^{[ 10 ]}

サンガー法以外の多くの第2世代および第3世代DNAシーケンシング技術は、処理能力の向上とコスト削減という共通の目標のもと、開発されてきた、あるいは現在開発中であり、それによって個別化遺伝子医療を完全に実現することを目指している。

X Prize Foundation (米国カリフォルニア州サンタモニカ)が支援する1,000 万米ドルのArchon X Prize for Genomicsと、米国国立衛生研究所(NIH)の国立ヒトゲノム研究所(NHGRI) が支援する 7,000 万米ドルの助成金は、新しい DNA シーケンス技術の開発における研究活動の急速な増加を後押ししている。^{[ 7 ]}

DNAシーケンシング技術はそれぞれ異なるアプローチ、手法、戦略に基づいているため、それぞれに長所と短所があります。表1では、様々な第2世代および第3世代DNAシーケンシング技術における重要なパラメータの比較を示しています。