DNAシーケンサー

454 DNAシーケンサーは、商業的に成功した最初の次世代シーケンサーでした。^{[ 10 ]}これは454 Life Sciencesによって開発され、2007年にロシュによって買収されました。454は、テンプレート株にヌクレオチドを追加する際にDNAポリメラーゼ反応によって放出されるピロリン酸の検出を利用します。

ロシュは、パイロシーケンシング技術に基づいて、GS FLX+ と GS Junior システムの 2 つのシステムを製造しました。^{[ 11 ]} GS FLX+ システムは、約 1000 塩基対のリード長を約束し、GS Junior システムは 400 塩基対のリードを約束します。^{[ 12 ] [ 13 ]} GS FLX+ の前身である 454 GS FLX Titanium システムは 2008 年にリリースされ、1 回のランで 0.7G のデータ出力、品質フィルター後の精度 99.9%、最大 700bp のリード長を実現しました。2009 年に、ロシュは 454 シーケンサーの卓上バージョンである GS Junior を発売しました。リード長は最大 400bp、ライブラリの準備とデータ処理が簡素化されています。

454 システムの利点の 1 つは、その実行速度です。ライブラリー調製の自動化とエマルジョン PCR の半自動化により、人員を削減できます。454 システムの欠点は、同一のヌクレオチドの長い文字列の塩基数を推定する際にエラーが発生しやすいことです。これはホモポリマー エラーと呼ばれ、6 つ以上の同一の塩基が連続している場合に発生します。^{[ 14 ]}もう 1 つの欠点は、試薬の価格が他の次世代シーケンサーと比較して比較的高価であることです。

2013年、ロシュは、454テクノロジーの開発を中止し、2016年に454マシンを完全に段階的に廃止すると発表した。これは、同社のテクノロジーが競争力を失ったためである。^{[ 15 ] [ 16 ]}

ロシュは、454シーケンスデータの解析に最適化されたソフトウェアツールを多数開発している。^{[ 17 ]}例えば、

• GS Run Processor は、シーケンスランで生成された生の画像を強度値に変換します。^{[ 18 ]}このプロセスは、画像処理と信号処理の 2 つの主要なステップで構成されています。また、このソフトウェアは、個々のリードに対して正規化、信号補正、塩基コール、および品質スコアを適用します。このソフトウェアは、データ解析アプリケーション (GS De Novo Assembler、GS Reference Mapper、または GS Amplicon Variant Analyzer) で使用するために、Standard Flowgram Format (または SFF) ファイルでデータを出力します。
• GS De Novo Assemblerは、ショットガンリードのみ、または454シーケンサーで生成されたペアエンドデータと組み合わせた最大3GBのサイズの全ゲノムをde novoアセンブリするためのツールです。また、転写産物のde novoアセンブリ（解析を含む）やアイソフォームバリアントの検出もサポートしています。^{[ 17 ]}
• GS Reference Mapperは、短いリードをリファレンスゲノムにマッピングし、コンセンサス配列を生成します。このソフトウェアは、挿入、欠失、SNPを示す評価用の出力ファイルを生成できます。あらゆるサイズの大規模で複雑なゲノムを処理できます。^{[ 17 ]}
• 最後に、GS Amplicon Variant Analyzerは、アンプリコンサンプルからのリードをリファレンスにアラインメントし、バリアント（連鎖しているか否かを問わず）とその頻度を特定します。未知のバリアントや低頻度のバリアントの検出にも使用できます。アラインメントの分析のためのグラフィカルツールが含まれています。^{[ 17 ]}

Illuminaは、 Manteia Predictive Medicineから買収しSolexaが開発した技術を用いて、多数の次世代シーケンシングマシンを製造している。 ^{[ 19 ]} Illuminaはこの技術を用いて、HiSeq、Genome Analyzer IIx、MiSeq、マイクロアレイも処理できるHiScanSQなど、多数の次世代シーケンシングマシンを製造している。^{[ 20 ]}

これらのDNAシーケンサーにつながる技術は、2006年にSolexa社がGenome Analyzerとして初めて発表しました。^{[ 10 ]} Illumina社は2007年にSolexa社を買収しました。Genome Analyzerは、合成によるシーケンス法を使用しています。最初のモデルは1回のランで1Gを生成しました。2009年には、出力は8月の1回のランで20Gから12月の1回のランで50Gに増加しました。2010年、Illumina社はHiSeq 2000をリリースし、出力は1回のランで200G、その後600Gとなり、8日間かかりました。HiSeq 2000は、北京ゲノム​​研究所の見積もりによると、100万塩基あたり0.02ドルという、リリース当時最も安価なシーケンスプラットフォームの1つを提供しました。

2011年にイルミナはMiSeqと呼ばれる卓上型シーケンサーを発売した。発売当初、MiSeqは1回のランで150bpのペアエンドリードで1.5Gを生成できた。自動DNAサンプル調製を使用すれば、シーケンスランは10時間で完了できる。^{[ 10 ]}

Illumina HiSeqは、シーケンス品質を評価するためにDNAクラスターの数と位置を計算する2つのソフトウェアツール、HiSeq制御システムとリアルタイムアナライザーを使用します。これらの方法は、近くのクラスターが互いに干渉しているかどうかを評価するのに役立ちます。^{[ 10 ]}

ライフテクノロジーズ（現サーモフィッシャーサイエンティフィック）は、アプライドバイオシステムズとイオントレントのブランドでDNAシーケンサーを製造しています。アプライドバイオシステムズは、SOLiD次世代シーケンシングプラットフォーム^{[ 21 ]}と、3500 Genetic AnalyzerなどのサンガーベースのDNAシーケンサーを製造しています^{[ 22 ]} 。イオントレントブランドでは、アプライドバイオシステムズは、Ion PGMシステム、Ion Protonシステム、Ion S5、Ion S5xlシステムの4つの次世代シーケンサーを製造しています^{[ 23 ]} 。同社はまた、2018年初頭に発売予定のSeqStudioと呼ばれる新しいキャピラリーDNAシーケンサーを開発していると考えられています^{[ 24 ]。}

SOLiD systemsは2006年にApplied Biosystemsに買収されました。SOLiDはライゲーションとデュアルベースエンコーディングによるシーケンス処理を採用しています。最初のSOLiDシステムは2007年に発売され、1回のランで35bpの読み取り長と3Gのデータを生成します。5回のアップグレードを経て、2010年に5500xlシーケンスシステムがリリースされ、読み取り長が85bpに大幅に増加し、精度が最大99.99%に向上し、7日間のランで30Gのデータを生成します。^{[ 10 ]}

SOLiDのリード長が限られていることは依然として大きな欠点であり^{[ 25 ]}、再シーケンスやトランスクリプトーム解析、最近ではChIP-Seqやメチル化実験など、リード長がそれほど重要でない実験にその使用がある程度限定されてきた^{[ 10 ]} 。Tecanシステムなどのシーケンスライブラリ調製の自動化により、SOLiDシステムのDNAサンプル調製時間は大幅に短縮された^{[ 10 ] 。}

SOLiDプラットフォームによって生成されたカラースペースデータは、さらなる解析のためにDNA塩基にデコードできますが、元のカラースペース情報を考慮するソフトウェアの方がより正確な結果が得られます。Life Technologiesは、再シーケンス、ChiP-Seq、トランスクリプトーム解析のためのデータ解析パッケージであるBioScope ^{[ 26 ]}をリリースしました。これはMaxMapperアルゴリズムを使用してカラースペースリードをマッピングします。

ベックマン・コールター（現ダナハー）は、CEQ 8000 を含む、CEQ というモデル名で、鎖終結法とキャピラリー電気泳動法に基づく DNA シーケンサーを製造していました。^{[ 27 ]}同社は現在、ダイターミネーターシーケンシングを使用する GeXP 遺伝子解析システムを製造しています。^{[ 28 ]}この方法は、PCRとほぼ同じようにサーマルサイクラーを使用して、DNA 断片を変性、アニーリング、伸長させ、配列決定された断片を増幅します。^{[ 29 ] [ 30 ]}

Pacific Biosciences は、シングル分子リアルタイムシーケンス(SMRT) 法を使用して PacBio RS および Sequel シーケンスシステムを製造しています。 ^{[ 31 ]}このシステムは、数千塩基対のリード長を生成できます。高い生リードエラーは、同じ鎖を何度も読み取る環状コンセンサス、または最適化されたアセンブリ戦略を使用して修正されます。^{[ 32 ]}科学者は、これらの戦略で 99.9999% の精度を報告しています。^{[ 33 ]} Sequel システムは、容量が増加し、価格が下がった状態で 2015 年に発売されました。^{[ 34 ] [ 35 ]}

オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズのMinIONシーケンサーは、進化するナノポアシーケンシング技術を核酸分析に応用したものです。^{[ 37 ]}このデバイスは長さ4インチで、USBポートから電源を取ります。MinIONは、分子が膜に懸濁されたナノポアを毎秒450塩基の速度で通過する際に、DNAを直接解読します。 ^{[ 38 ]}電流の変化によって、どの塩基が存在するかが示されます。当初、このデバイスの精度は60～85%でしたが、従来のマシンでは99.9%でした。^{[ 39 ]}不正確な結果であっても、長いリード長が得られるため有用である可能性があります。^{[ 40 ]} 2021年初頭、ブリティッシュコロンビア大学の研究者らは、特殊な分子タグを使用して、一度に多くの長いDNA断片をシーケンスする場合でも、デバイスの5～15%のエラー率を0.005%未満に低減することに成功しました。^{[ 41 ]} MinIONをベースにした製品バージョンがさらに2つあります。 1つ目はGridIONで、これは少し大きめのシーケンサーで、一度に最大5つのMinIONフローセルを処理できます。2つ目はPromethIONで、最大10万個のポアを並列に使用し、大容量シーケンスに適しています。^{[ 42 ]}

MGIは、独自のDNBSEQ技術に基づいて、DNBSEQ-G50、DNBSEQ-G400、DNBSEQ-T7などの科学研究および臨床アプリケーション向けのハイスループットシーケンサーを製造しています。^{[ 43 ]}これは、 DNAナノボールシーケンシングと組み合わせプローブアンカー合成技術に基づいており、DNAナノボール（DNB）は流体システムを介してパターン化されたアレイチップにロードされ、その後、ハイブリダイゼーションのためにシーケンシングプライマーがDNBのアダプター領域に追加されます。DNBSEQ-T7は、1日に最大60個のヒトゲノムという非常に大規模なショートリードを生成できます。^{[ 44 ]} DNBSEQ-T7は、SARS-CoV-2またはCOVID-19のゲノムをシーケンスして重症COVID-19疾患の遺伝的変異素因を特定するために、30倍のシーケンスで150 bpのペアエンドリードを生成するために使用されました。^{[ 45 ]}中国国立遺伝子バンクの研究者らは、新しい技術を用いて、 MGIのPCRフリーDNBSEQアレイ上でPCRフリーライブラリーのシーケンスを行い、初めて真のPCRフリー全ゲノムシーケンスを実現した。^{[ 46 ]} Nature Medicineに掲載されたように、MGISEQ-2000は、COVID-19患者の根本的な病態生理と回復を研究するためのシングルセルRNAシーケンスに使用された。^{[ 47 ]}