ゲノムスキミング

ゲノムスキミングは、ゲノムのローパスで浅いシーケンシング（最大5％）を使用して、ゲノムスキムと呼ばれるDNAの断片を生成するシーケンシング手法です。^{[1] [2]}これらのゲノムスキムには、ゲノムの高コピー画分に関する情報が含まれています。^[2]ゲノムの高コピー画分は、リボソームDNA、プラスチドゲノム（プラストーム）、ミトコンドリアゲノム（ミトゲノム）、およびマイクロサテライトや転移因子などの核反復配列で構成されています。^[3]これらのスキムを生成するために 、ハイスループットの次世代シーケンシング技術が採用されています。^[1]これらのスキムは「ゲノム氷山の一角」に過ぎませんが、それらの系統ゲノム解析により、従来の方法よりも低コストで大規模に進化の歴史と生物多様性に関する洞察が得られます。^{[2] [3] [4]}ゲノムスキミングに必要なDNAの量が少ないため、その方法論はゲノミクス以外の分野にも応用できる。このようなタスクには、食品業界における製品のトレーサビリティの決定、生物多様性と生物資源に関する国際規制の施行、法医学などが含まれる。^[5]

ゲノムスキミングは、より小さなオルガネラゲノムのアセンブリに加えて、系統ゲノム研究のための保存された相同遺伝子配列を発見するためにも使用できます。多細胞病原体の系統ゲノム研究では、ゲノムスキミングを使用してエフェクター遺伝子を見つけ、内部共生生物を発見し、ゲノム変異を特徴付けることができます。^[6]

内部転写スペーサー（ITS）は、真核生物の18-5.8-28S rDNA内の非コード領域であり、ゲノムスキミング研究で使用されてきたrDNAの特徴の1つです。^[7] ITSは種間の変動性が高いため、属内の異なる種を検出するために使用されます。 ^[7]これらは個体変動性が低いため、異なる株や個体の識別を妨げます。^{[7]これらはすべての}真核生物に存在し、進化率が高く、種間および種間の系統解析に使用されてきました。 ^[7]

核rDNAをターゲットとする場合、最終的なシーケンス深度は最低100倍にし、5倍未満の深度のシーケンスはマスクすることが推奨されています。 ^[1]

プラスチドゲノム（プラストーム）は、植物内に多く存在し（細胞DNAの約3-5%）、サイズが小さく、構造が単純で、核遺伝子やミトコンドリア遺伝子よりも遺伝子構造が保存されていることから、ゲノムスキミングを用いた同定や進化研究で広く利用されている。^{[8] [9]}プラスチド研究はこれまで、従来の方法では評価できる領域の数に制限があった。^{[9]ゲノムスキミングを使用すれば、プラスチドゲノム（プラストーム）全体の配列決定を、}サンガー配列決定などの一般的な配列決定方法に必要なコストと時間のほんの一部で行うことができる。^{[3]プラストームは、} rbcLバーコード遺伝子やmatKバーコード遺伝子など、植物の従来のDNAバーコードを置き換える方法として提案されている。 ^[ 3]一般的なDNAバーコードと比較すると、ゲノムスキミングでは塩基当たりのコストが10分の1でプラストームを生成できる。^[5]プラストームのゲノムスキムの最近の利用により、系統発生の解像度が向上し、分類群内の特定のグループの差別化が進み、生物多様性のより正確な推定が可能になりました。^[9]さらに、プラストームは、属内の種を比較して、グループ内の進化の変化と多様性を調べるために使用されています。^[9]

プラストームをターゲットとする場合、高品質のアセンブリを保証するために、単一コピー領域に対して最低30倍の最終シーケンス深度を達成することが推奨されています。20倍深度未満の一塩基多型（SNP）はマスクする必要があります。 ^[1]

ミトコンドリアゲノム（ミトゲノム）は、母性遺伝、細胞内のコピー数が多い、組み換えが起こらない、突然変異率が高いなどの理由から、さまざまな研究で分子マーカーとして使用されています。ミトコンドリアゲノムは、環状の二本鎖DNA分子構造を持ち、約15～20キロベースで、37個のリボソームRNA遺伝子、13個のタンパク質コード遺伝子、22個の転移RNA遺伝子を持ち、後生動物グループ全体で非常に均一であるため、系統発生研究によく使用されます。COI、NADH2、16S rRNA 、 12S rRNAなどのミトコンドリアバーコード配列も、分類学的同定に使用できます。^{[10]完全な}ミトゲノムの公開が増えたこと により、多くの分類群にわたる堅牢な系統発生の推測が可能になり、遺伝子再編成や可動性遺伝要素の位置などのイベントを捉えることができます。ゲノムスキミングを用いて完全なミトゲノムを組み立てることで、多くの生物の系統発生史と生物多様性を解明することができます。^[4]

ミトゲノムをターゲットとする場合、ミトゲノムは植物種によってサイズや複雑さの面でより多様なため、反復配列の組み立てが難しくなるため、最終的な最小シーケンス深度に関する具体的な提案はありません。ただし、高度に保存されたコーディング配列と非反復フランキング領域は、リファレンスガイドアセンブリを使用して組み立てることができます。配列は、プラストームや核リボソームDNAをターゲットとする場合と同様にマスクする必要があります。^[1]

ゲノム中の核反復配列は、系統発生データの十分に活用されていない情報源である。核ゲノムの 5% を配列すると、核反復配列の何千ものコピーが存在することになる。配列された反復配列はゲノム全体の反復配列の代表に過ぎないが、これらの配列された部分はゲノムの豊富さを正確に反映していることがわかっている。これらの反復配列はde novo でクラスター化することができ、その豊富さを推定することができる。これらの反復配列の種類の分布と発生は系統発生的に有益であり、さまざまな種の進化の歴史に関する情報を提供することができる。^[1]

低コピーDNAは、進化発生学や系統発生学の研究に有用であることが証明されています。^{[11 ] 低コピーDNAは、保存された}相同遺伝子、単一コピーの保存された相同遺伝子、共有コピー遺伝子を含むデータベースからプライマーを開発するなど、さまざまな方法で高コピー画分から採掘できます。 ^[11]別の方法は、Hyb-Seqを介したトランスクリプトミクスを使用して、低コピー遺伝子を標的とする新しいプローブを探すことです。^[11]ゲノムスキムを使用して組み立てられた核ゲノムは非常に断片化されていますが、一部の低コピー単一コピー核遺伝子は正常に組み立てることができます。^[12]

劣化したDNAを回収するこれまでの方法は、サンガー法に基づいており、大きな無傷のDNAテンプレートに依存していたため、汚染や保存方法の影響を受けていた。一方、ゲノムスキミングは、DNAが著しく劣化し、ほとんど残っていないことが多い植物標本館や博物館に保存されている種から遺伝情報を抽出するために使用できる。 ^{[4] [13]}植物の研究では、80年前のDNAや500 pgの劣化DNAでも、ゲノムスキミングを使用してゲノム情報を推測できることが示されている。^[13]植物標本館では、収量が少なく品質の低いDNAであっても、ある研究では、下流の分析のために「高品質の完全な葉緑体およびリボソームDNA配列」を大規模に生成することができた。^[14]

フィールド研究では、無脊椎動物はエタノールに保存されますが、これは通常、DNAベースの研究では廃棄されます。^[15]ゲノムスキミングは、このエタノール画分から少量のDNAを検出し、画分内の標本のバイオマス、外組織層の微生物叢、嘔吐反射によって放出された腸の内容物（獲物など）に関する情報を提供することが示されています。 [15] このように、ゲノムスキミングは、低コピーDNAを介して生態学を理解するための追加の方法を提供することができます。 [ ^{15 ]}

DNA 抽出プロトコルは、サンプルのソース (植物、動物など) によって異なります。ゲノムスキミングでは、次の DNA 抽出プロトコルが使用されています。

ライブラリの準備プロトコルは、生物、組織の種類など、さまざまな要因によって異なります。保存された標本の場合は、特定のライブラリの準備プロトコルを変更する必要がある場合があります。^[1]ゲノムスキミングでは、次のライブラリの準備プロトコルが使用されています。

短いリードまたは長いリードによるシーケンシングは、標的ゲノムまたは遺伝子によって異なります。核反復中のマイクロサテライトには長いリードが必要です。^[23]ゲノムスキミングでは、次のシーケンシングプラットフォームが使用されています。

イルミナMiSeqプラットフォームは、短い読み取りに対して長い読み取り長を実現するため、一部の研究者に選ばれています。^[6]

ゲノムスキミング後、高コピーのオルガネラDNAはリファレンスガイドを使用してアセンブルするか、またはde novoでアセンブルすることができます。高コピーの核反復配列はde novoでクラスター化することができます。^[1]選択されるアセンブラーは、ターゲットゲノムと、短い読み取りと長い読み取りのどちらが使用されるかによって異なります。ゲノムスキムからゲノムをアセンブルするために、以下のツールが使用されてきました。

注釈は、ゲノムアセンブリ内の遺伝子を識別するために使用されます。選択される注釈ツールは、ターゲットゲノムとそのゲノムのターゲット機能によって異なります。以下の注釈ツールは、オルガネラゲノムに注釈を付けるゲノムスキミングで使用されています。

組み立てられた配列は全体的に整列され、系統樹は系統樹再構築ソフトウェアを使用して推定されます。系統樹再構築に選択されるソフトウェアは、最大尤度 (ML)、最大節約 (MP)、またはベイズ推論 (BI)法のどれが適切であるかによって異なります。ゲノムスキミングでは、次の系統樹再構築プログラムが使用されています。

ゲノムスキミングの下流プロセスを自動化するために、さまざまなプロトコル、パイプライン、バイオインフォマティクス ツールが開発されています。

Hyb-Seqは、ターゲットエンリッチメントとゲノムスキミングを組み合わせた、低コピー核遺伝子を捕捉するための新しいプロトコルです。^[29]低コピー遺伝子座のターゲットエンリッチメントは、特定のシングルコピーエクソン用に設計されたエンリッチメントプローブによって達成されますが、ターゲット生物の核ドラフトゲノムとトランスクリプトームが必要です。次に、ターゲットエンリッチメントライブラリをシーケンスし、結果として得られたリードを処理、アセンブル、および識別します。オフターゲットリードを使用して、rDNAシストロンと完全なプラストームをアセンブルすることもできます。このプロセスを通じて、Hyb-Seqは系統ゲノム学のためのゲノム規模のデータセットを作成できます。

GetOrganelleは、ゲノムスキミングリードを使用してオルガネラゲノムを組み立てるツールキットです。^[30]オルガネラ関連リードは、修正された「ベイティングおよび反復マッピング」アプローチを使用してリクルートされます。Bowtie2 ^[31]を使用してターゲットゲノムにアラインメントされたリードは、「シードリード」と呼ばれます。シードリードは、複数の反復拡張を介してより多くのオルガネラ関連リードをリクルートするための「ベイト」として使用されます。リード拡張アルゴリズムは、ハッシュアプ​​ローチを使用します。このアプローチでは、リードが「ワード」と呼ばれる特定の長さの部分文字列にカットされます。各拡張反復で、これらの「ワード」は「ベイトプール」と呼ばれるハッシュテーブルに追加され、反復ごとにサイズが動的に増加します。ゲノムスキムのシーケンスカバレッジが低いため、非ターゲットリードは、ターゲットリードとのシーケンス類似性が高いものであっても、ほとんどリクルートされません。 GetOrganelleは最終的にリクルートされたオルガネラ関連リードを使用して、SPAdesを使用してde novoアセンブリを実行します。^[32]アセンブリグラフはフィルタリングされ、もつれが解かれ、グラフのすべての可能なパスが生成され、したがって環状オルガネラゲノムのすべての構成が生成されます。

Skmerは、クエリゲノムスキムと参照ゲノムスキム間のゲノム距離を計算するための、アセンブリフリーかつアラインメントフリーのツールです。^{[33] Skmerは、これらの距離を計算するために2段階のアプローチを使用します。まず、JellyFish [34]}と呼ばれるツールを使用してk-mer頻度プロファイリングを生成し、次にこれらのk-merをハッシュに変換します。^[33]これらのハッシュのランダムなサブセットが選択され、いわゆる「スケッチ」を形成します。^[33]第2段階では、SkmerはMash ^[35]を使用して、これらのスケッチのうち2つのJaccardインデックスを推定します。 ^[33]これら2つの段階の組み合わせを使用して、進化距離を推定します。^[33]

Geneiousは、GUIベースのプラットフォーム内に他のツールを組み込むことで、アセンブリ、アライメント、系統学などのバイオインフォマティクス解析のさまざまなステップを実行できる統合ソフトウェアプラットフォームです。 ^{[18] [28]}

PhyloHerbはPythonで書かれたバイオインフォマティクスパイプラインです 。組み込みのデータベースまたはユーザー指定の参照を使用して、BLAST検索によりプラスチド、ミトコンドリア、核リボソーム領域から相同配列を抽出します。 ^[36]

ゲノムスキミングは、通常、オルガネラゲノムをシーケンスするための費用対効果の高い方法として選択されますが、（ディープ）全ゲノムシーケンスデータがすでに取得されている場合は、ゲノムスキミングをシリコで行うことができます。ゲノムスキミングは、シリコゲノムスキミングを介して核ゲノムのリードをサブサンプリングすることにより、オルガネラゲノムアセンブリを簡素化することが実証されています。^{[37] [38]}オルガネラゲノムは細胞内で高コピーになるため、シリコゲノムスキミングは基本的に核配列をフィルター処理し、アセンブリのためにオルガネラ対核配列の比率を高め、アセンブリパラダイムの複雑さを軽減します。シリコゲノムスキミングは、最初に概念実証として行われ、リードタイプ、リード長、およびシーケンスカバレッジのパラメーターを最適化しました。^[1]

上記の現在の用途以外にも、ゲノムスキミングは花粉混合物の定量化、^{[19]特定の個体群の監視と保全 [ 39]}などの他のタスクにも適用されています。ゲノムスキミングは、種全体の一塩基多型を調べるための変異呼び出しにも使用できます。 ^[22]

ゲノムスキミングは、1回の実行で複数のデータセット（プラスチド、ミトコンドリア、核）が生成されるため、大規模で浅いデータセットを生成するための費用対効果が高く、迅速かつ信頼性の高い方法です。 ^{[5] [3]}実装が非常に簡単で、実験室での作業や最適化が少なく、生物やそのゲノムサイズに関する事前の知識も必要ありません。 ^[3]これにより、膨大なリソースを投入することなく、生物学的調査や仮説生成のための低リスクの手段が提供されます。^[6]

ゲノムスキミングは、植物標本館や博物館のコレクションの標本など、ゲノムDNAが古く化学処理によって劣化している場合に特に有利なアプローチです。 ^[4]ゲノムリソースはほとんど未活用です。ゲノムスキミングにより、希少種や絶滅種の分子特性を解析できます。^{[5]エタノールでの保存プロセスはゲノムDNAに損傷を与えることが多く、標準的なPCRプロトコル[3]}やその他のアンプリコンベースのアプローチの成功を妨げます。 ^[5]これにより、DNA濃縮や増幅を必要とせずに、非常に低いDNA濃度のサンプルをシーケンスする機会が得られます。ゲノムスキミングに特有のライブラリ調製は、イルミナが推奨する量の135分の1である37 ng（0.2 ng/ul）という低濃度のDNAでも機能することが示されています。^[1]

ゲノムスキミングは主に高コピー数のプラストームとミトゲノムの抽出に使用されますが、低コピー数の核配列の部分的な配列も提供できます。これらの配列は系統ゲノム解析には不十分かもしれませんが、ハイブリダイゼーションベースのアプローチのためのPCRプライマーとプローブを設計するには十分です。^[1]

ゲノムスキミングは特定のプライマーに依存せず、遺伝子再編成の影響を受けません。^[4]

ゲノムスキミングはゲノムの表面を削るだけなので、遺伝子予測や注釈を必要とする生物学的な疑問には不十分です。^[6]これらの下流のステップは、より深く意味のある分析に必要です。

プラスチドゲノム配列はゲノムスキム中に豊富に存在するが、プラスチド起源のミトコンドリアおよび核擬遺伝子の存在はプラストームアセンブリに潜在的に問題を引き起こす可能性がある。^[1]

シーケンス深度とリードタイプ、およびゲノムターゲット（プラストーム、ミトゲノムなど）の組み合わせは、シングルエンドアセンブリとペアエンドアセンブリの成功に影響を与えるため、これらのパラメータは慎重に選択する必要があります。^[1]

ゲノムスキミングのウェットラボとバイオインフォマティクスの両方の部分に、スケーラビリティに関する課題があります。ゲノムスキミングのシーケンシングのコストは2016年現在1Gbあたり80ドルと手頃ですが、シーケンシングのためのライブラリの準備は依然として非常に高価で、少なくとも1サンプルあたり約200ドルかかります（2016年現在）。さらに、ほとんどのライブラリ準備プロトコルは、まだロボットによる完全な自動化には至っていません。バイオインフォマティクス側では、ゲノムスキミングから得られる大量のデータを処理するために、大規模で複雑なデータベースと自動化されたワークフローを設計する必要があります。次のプロセスの自動化を実装する必要があります。^[40]

1. 標準バーコードの組み立て
2. 細胞小器官DNA（および核リボソームタンデムリピート）の組み立て
3. 組み立てられたさまざまなフラグメントの注釈
4. 潜在的な汚染物質の配列の除去
5. 単一コピー遺伝子の配列カバレッジの推定
6. 単一コピー遺伝子に対応するリードの抽出
7. 小型ショットガンシーケンシングまたはDNA断片からの未知の標本の識別
8. 環境DNAのショットガンシーケンシングによるさまざまな生物の同定（メタゲノミクス）

上記の「ツールとパイプライン」セクションに示されているように、これらのスケーラビリティの課題の一部はすでに実装されています。