タンパク質配列決定

加水分解は、タンパク質のサンプルを6 M塩酸中で100～110  ℃で24時間以上加熱することによって行われます。かさ高い疎水性基を多く持つタンパク質は、より長い加熱時間が必要になる場合があります。しかし、これらの条件は非常に厳しいため、一部のアミノ酸（セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン、システイン）が分解されます。この問題を回避するために、Biochemistry Onlineは、別々のサンプルを異なる時間加熱し、得られた各溶液を分析し、加水分解時間をゼロに外挿することを提案しています。Rastallは、チオール試薬やフェノールなど、トリプトファンとチロシンを塩素による攻撃から保護し、システインを前酸化するなど、分解を防止または軽減するためのさまざまな試薬を提案しています。また、アミド加水分解の程度を決定するために、発生したアンモニアの量を測定することも提案しています。

アミノ酸はイオン交換クロマトグラフィーで分離した後、検出を容易にするために誘導体化することができる。より一般的には、アミノ酸を誘導体化した後、逆相HPLCで分離する。

イオン交換クロマトグラフィーの一例として、NTRCはスルホン化ポリスチレンをマトリックスとして使用し、酸性溶液中のアミノ酸を添加し、pHを徐々に上昇させた緩衝液をカラムに通す方法を示している。アミノ酸は、pHがそれぞれの等電点に達したときに溶出される。アミノ酸が分離されたら、着色誘導体を形成する試薬を添加して、それぞれの量を測定する。アミノ酸の量が10 nmolを超える場合は、ニンヒドリンを用いることができる。ニンヒドリンはプロリンと反応すると黄色になり、他のアミノ酸と反応すると鮮やかな紫色になる。アミノ酸の濃度は、得られた溶液の吸光度に比例する。10 pmol程度のごく少量の場合は、オルトフタルアルデヒド（OPA）やフルオレスカミンなどの試薬を用いて蛍光誘導体を形成できる。

プレカラム誘導体化では、エドマン試薬を用いてUV光で検出可能な誘導体を生成する。蛍光誘導体を生成する試薬を用いると、より高い感度が得られる。誘導体化されたアミノ酸は、通常C8またはC18シリカカラムと最適化された溶出勾配を用いた逆相クロマトグラフィーにかけられる。溶出されたアミノ酸はUV検出器または蛍光検出器で検出され、そのピーク面積を誘導体化標準物質のピーク面積と比較することで、試料中の各アミノ酸を定量する。

約50～70アミノ酸より長いペプチドは、エドマン分解法では確実に配列決定することができません。そのため、長いタンパク質鎖は小さな断片に分解し、それぞれの断片を個別に配列決定する必要があります。分解は、トリプシンやペプシンなどのエンドペプチダーゼ、または臭化シアンなどの化学試薬によって行われます。酵素によって切断パターンが異なるため、断片間の重複を利用して全体の配列を構築することができます。

配列決定するペプチドは固体表面に吸着される。一般的な基板の一つは、カチオン性ポリマーであるポリブレンでコーティングされたガラス繊維である。吸着したペプチドに、エドマン試薬であるフェニルイソチオシアネート（PITC）と、12%トリメチルアミンの弱塩基性緩衝溶液を加える。これにより、N末端アミノ酸のアミノ基と反応する。

末端アミノ酸は、無水酸を添加することで選択的に分離できる。得られた誘導体は異性化して置換フェニルチオヒダントインとなり、これを洗浄してクロマトグラフィーで同定し、このサイクルを繰り返すことができる。各ステップの効率は約98%であり、これにより約50種類のアミノ酸を確実に同定できる。

タンパク質シークエンサー^{[ 3 ]}は、エドマン分解を自動化して行う装置です。タンパク質またはペプチドのサンプルをタンパク質シークエンサーの反応容器に固定し、エドマン分解を行います。各サイクルで、タンパク質またはペプチドのN末端から1つのアミノ酸が遊離して誘導体化され、遊離したアミノ酸誘導体はHPLCによって同定されます。シーケンス処理は、測定可能な配列全体が確立されるか、またはあらかじめ定められたサイクル数に達するまで、ポリペプチド全体に対して繰り返し行われます。

タンパク質同定のための一般的なスキームについて説明します。^{[ 4 ] [ 5 ]}

1. 目的化合物は、通常、SDS-PAGEまたはクロマトグラフィーによって単離される。
2. 単離されたPOIは、システイン残基を安定化させるために化学的に修飾される場合がある（例：S-アミドメチル化またはS-カルボキシメチル化）。
3. 目的タンパク質（POI）は、特定のプロテアーゼで消化され、ペプチドが生成されます。リジンまたはアルギニン残基のC末端側を選択的に切断するトリプシンは、最も一般的に使用されるプロテアーゼです。その利点としては、i) タンパク質中にリジンおよびアルギニン残基が頻繁に存在すること、ii) 酵素の特異性が高いこと、iii) 酵素が安定していること、iv) トリプシン消化ペプチドが質量分析に適していることなどが挙げられます。
4. ペプチドは、イオン化可能な不純物を除去するために脱塩され、MALDI-TOF質量分析にかけられる。ペプチドの質量を直接測定することで、タンパク質を同定するのに十分な情報が得られる場合もある（ペプチド質量フィンガープリンティングを参照）が、ペプチドの配列に関する情報を得るために、質量分析計内でペプチドをさらに断片化することがしばしば用いられる。あるいは、ペプチドを脱塩し、逆相HPLCで分離した後、 ESIイオン源を介して質量分析計に導入することもできる。LC-ESI-MSは、タンパク質同定に関してMALDI-MSよりも多くの情報を提供できる可能性があるが、装置の使用時間が長くなる。
5. 質量分析計の種類によって、ペプチドイオンの断片化は、衝突誘起解離（CID）やポストソース分解（PSD）など、さまざまなメカニズムで起こり得る。いずれの場合も、ペプチドの断片イオンのパターンから、その配列に関する情報が得られる。
6. 推定ペプチドイオンおよびそのフラグメントイオンの測定質量を含む情報は、タンパク質配列データベースの概念的（インシリコ）プロテオリシスおよびフラグメンテーションから計算された質量値と照合されます。スコアが分析パラメータに基づく閾値を超えた場合、一致が成立します。実際のタンパク質がデータベースに存在しない場合でも、エラー許容マッチングにより、相同タンパク質との類似性に基づいてタンパク質を推定的に同定できます。この分析を実行するための様々なソフトウェアパッケージが利用可能です。
7. ソフトウェアパッケージは通常、同定された各タンパク質の識別情報（アクセッションコード）、一致スコアを示すレポートを生成し、複数のタンパク質が同定された場合は、一致の相対的な強さを示す指標も提供します。
8. 同定されたタンパク質の配列上で一致するペプチドの図は、配列カバレッジ（ペプチドとして検出されたタンパク質の割合）を示すためによく用いられます。POIが一致するタンパク質よりも著しく小さいと考えられる場合、この図はPOIが同定されたタンパク質のN末端断片かC末端断片かを示唆する可能性があります。

ペプチドの断片化パターンから、de novoシーケンス法によって直接配列を決定することができる。この配列は、タンパク質配列データベースとの照合や、翻訳後修飾または化学修飾の調査に利用できる。また、上記の方法で行われたタンパク質同定の補足的な証拠となる場合もある。

タンパク質同定時に一致するペプチドは、必ずしも一致したタンパク質に対して予測されたN末端またはC末端を含むとは限りません。これは、N末端またはC末端ペプチドが質量分析法（MS）で同定しにくい（例えば、短すぎるか長すぎる）、翻訳後修飾を受けている（例えば、N末端アセチル化）、あるいは予測と実際に異なっている、といったことが原因である可能性があります。翻訳後修飾や末端の切断は、データをより詳細に解析する（すなわち、de novoシーケンス解析を行う）ことで特定できる場合があります。特異性の異なるプロテアーゼを用いた繰り返し消化も有効な場合があります。

既知のタンパク質配列に基づく予測と質量分析データを詳細に比較することで翻訳後修飾を特定できる場合があるが、データ取得に的を絞ったアプローチを用いることもできる。例えば、リン酸化ペプチドを特異的に濃縮することで、タンパク質中のリン酸化部位を特定できる可能性がある。質量分析計におけるペプチド断片化の代替手法（ETDやECDなど）を用いることで、補完的な配列情報が得られる場合もある。

タンパク質の全質量は、そのアミノ酸残基の質量に水分子の質量を加えたもので、翻訳後修飾を考慮して調整されます。タンパク質は、そこから誘導されるペプチドほどイオン化されにくいものの、溶液中のタンパク質はESI-MSにかけられ、2万分の1以上の精度で質量を測定できる場合があります。これは多くの場合、末端を確認する（つまり、タンパク質の測定質量が配列から予測される質量と一致することを確認する）ことや、多くの翻訳後修飾の有無を推測するのに十分です。

プロテオリシスによって、POIの全配列を網羅する分析しやすいペプチド群が必ずしも得られるとは限らない。質量分析計におけるペプチドの断片化では、各ペプチド結合の切断に対応するイオンが得られない場合が多い。そのため、各ペプチドについて推定される配列は必ずしも完全ではない。標準的な断片化法では、ロイシン残基とイソロイシン残基は異性体であるため、両者を区別することはできない。

エドマン分解はタンパク質のN末端から進行するため、N末端が化学的に修飾されている場合（例えば、アセチル化やピログルタミン酸の形成など）は機能しません。また、エドマン分解は一般的にジスルフィド結合の位置を決定するのに適していません。さらに、明確な結果を得るには1ピコモル以上のペプチド量が必要となるため、質量分析法よりも感度が低くなります。