454 生命科学

ゲノムDNAはより小さな断片（300～800塩基対）に分画され、研磨（両端を鈍端にする）された。次に、短いアダプターが断片の両端に連結された。これらのアダプターは、サンプルライブラリー断片の増幅とシーケンスの両方のためのプライミング配列を提供した。1つのアダプター（アダプターB）には、 DNAライブラリーをストレプトアビジンコートビーズに固定するための5'ビオチンタグが含まれていた。ニック修復後、ビオチン化されていない鎖が解放され、一本鎖テンプレートDNA（sstDNA）ライブラリーとして使用された。sstDNAライブラリーの品質が評価され、emPCRに必要な最適な量（ビーズあたりのDNAコピー数）が滴定によって決定された。^{[ 13 ]}

sstDNAライブラリーをビーズに固定化した。ライブラリー断片を含むビーズは、単一のsstDNA分子を保持していた。ビーズに結合したライブラリーを、水中油型混合液中で増幅試薬と乳化させた。各ビーズはそれぞれ専用のマイクロリアクター内に捕捉され、そこでPCR増幅が行われた。これにより、ビーズに固定化されたクローン増幅DNA断片が得られた。

一本鎖テンプレートDNAライブラリービーズをDNAビーズインキュベーションミックス（DNAポリメラーゼ含有）に加え、酵素ビーズ（スルホリラーゼおよびルシフェラーゼ含有）と共にPicoTiterPlateデバイス上に重層した。デバイスを遠心分離してビーズをウェルに沈着させた。酵素ビーズの層により、シーケンス反応中にDNAビーズがウェル内に留まることが保証された。ビーズ沈着プロセスは、増幅されたライブラリービーズが1つ含まれるウェルの数を最大化するように設計された。

ロードされた PicoTiterPlate デバイスは、ゲノムシーケンサー FLX 装置にセットされました。流体サブシステムは、プレートのウェル全体にシーケンス試薬 (バッファーとヌクレオチドを含む) を供給しました。4 つの DNAヌクレオチドは、シーケンス実行中に PicoTiterPlate デバイス全体に固定された順序で順次追加されました。ヌクレオチドの流れの間、各ビーズに結合した数百万コピーの DNA が並行してシーケンスされました。テンプレート鎖に相補的なヌクレオチドがウェルに追加されると、ポリメラーゼはヌクレオチドを追加することによって既存の DNA 鎖を伸長しました。1 つ (または複数) のヌクレオチドの追加により、装置内の CCD カメラによって記録される光信号が生成されました。この技術は合成によるシーケンスに基づいており、パイロシークエンシングと呼ばれています。^{[ 14 ]}信号強度はヌクレオチドの数に比例します。たとえば、単一のヌクレオチドの流れに組み込まれたホモポリマーのストレッチは、単一のヌクレオチドよりも大きな信号を生成します。しかし、ホモポリマーの伸長部分のシグナル強度は、連続する8ヌクレオチドまでしか線形ではなく、その後シグナルは急速に低下した。^{[ 15 ]}データは、下流の解析のために標準フローグラム形式（SFF）ファイルに保存された。