細胞培養

細胞は、体外培養のために組織からいくつかの方法で分離できます。血液から細胞を簡単に精製できますが、培養で増殖できるのは白血球だけです。固形組織から細胞を分離するには、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼなどの酵素を使用して細胞外マトリックスを消化し、組織を撹拌して細胞を懸濁液中に放出します。^{[ 19 ] [ 20 ]}あるいは、組織片を培養培地に入れ、増殖した細胞を培養に使用できます。この方法は、組織片培養として知られています。

被験者から直接培養された細胞は、初代​​細胞と呼ばれます。腫瘍由来の細胞を除き、ほとんどの初代細胞培養の寿命は限られています。

確立された細胞株、あるいは不死化細胞株とは、ランダムな突然変異、またはテロメラーゼ遺伝子の人工発現などの意図的な改変によって、無限に増殖する能力を獲得した細胞株のことである。多くの細胞株は、特定の細胞型を代表するものとして確立されている。

For the majority of isolated primary cells, they undergo the process of senescence and stop dividing after a certain number of population doublings while generally retaining their viability (described as the Hayflick limit).

Aside from temperature and gas mixture, the most commonly varied factor in culture systems is the cell growth medium.^[21] Recipes for growth media can vary in pH, glucose concentration, growth factors, and the presence of other nutrients. The growth factors used to supplement media are often derived from the serum of animal blood, such as fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum, equine serum, and porcine serum. One complication of these blood-derived ingredients is the potential for contamination of the culture with viruses or prions, particularly in medical biotechnology applications. Current practice is to minimize or eliminate the use of these ingredients wherever possible and use human platelet lysate (hPL).^[22] This eliminates the worry of cross-species contamination when using FBS with human cells. hPL has emerged as a safe and reliable alternative as a direct replacement for FBS or other animal serum. In addition, chemically defined media can be used to eliminate any serum trace (human or animal), but this cannot always be accomplished with different cell types. Alternative strategies involve sourcing the animal blood from countries with minimum BSE/TSE risk, such as The United States, Australia and New Zealand,^[23] and using purified nutrient concentrates derived from serum in place of whole animal serum for cell culture.^[24]

Plating density (number of cells per volume of culture medium) plays a critical role for some cell types. For example, a lower plating density makes granulosa cells exhibit estrogen production, while a higher plating density makes them appear as progesterone-producing theca lutein cells.^[25]

細胞は浮遊培養または接着培養のいずれかで培養できます。^{[ 26 ]}血流中に存在する細胞のように、表面に付着せずに浮遊状態で自然に生存する細胞もあります。また、浮遊培養で生存できるように改変された細胞株もあり、接着条件よりも高密度で培養できます。接着細胞は、組織培養用プラスチックやマイクロキャリアなどの表面を必要とし、接着特性を高め、成長と分化に必要な他のシグナルを提供するために、細胞外マトリックス（コラーゲンやラミニンなど）成分でコーティングすることができます。固形組織由来の細胞のほとんどは接着性です。もう1つのタイプの接着培養はオルガノタイプ培養で、これは2次元培養皿ではなく3次元（3D）環境で細胞を培養します。この3D培養システムは、生化学的および生理学的に生体内組織により近いですが、多くの要因（拡散など）のために維持するのが技術的に困難です。^{[ 27 ]}

細胞株の交差汚染は、培養細胞を扱う科学者にとって問題となる可能性があります。^{[ 28 ]}研究によると、実験で使用される細胞は、15～20% の確率で誤って識別されたり、別の細胞株で汚染されたりしています。^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]}細胞株の交差汚染の問題は、薬剤スクリーニング研究で日常的に使用されているNCI-60 パネルの細胞株でも検出されています。 ^{[ 32 ] [ 33 ]}アメリカ培養細胞コレクション(ATCC)、欧州細胞培養コレクション (ECACC)、ドイツ微生物細胞培養コレクション (DSMZ)などの主要な細胞株リポジトリは、研究者から誤って識別された細胞株の提出を受けています。 ^{[ 32 ] [ 34 ]}このような汚染は、細胞培養株を使用して作成された研究の質に問題があり、主要なリポジトリは現在、すべての細胞株の提出を認証しています。^{[ 35 ]} ATCCは、細胞株の認証にショートタンデムリピート（STR）DNAフィンガープリンティングを使用しています。 ^{[ 36 ]}

細胞株の交差汚染の問題に対処するため、研究者は細胞株の同一性を確立するために、初期継代で細胞株を認証することが推奨されます。認証は、細胞株ストックを凍結する前、活発な培養中は 2 か月ごと、および細胞株を使用して生成された研究データを公表する前に繰り返す必要があります。細胞株を識別するために、アイソザイム分析、ヒトリンパ球抗原(HLA) タイピング、染色体分析、核型分析、形態学、STR 分析など、多くの方法が使用されています。^{[ 36 ]}

重要な細胞株の交差汚染物質の 1 つは、不死化HeLa細胞株です。HeLa による汚染は、1960 年代初頭に米国で非ヒト培養において初めて確認されました。70 年代には、19 の細胞株で種内汚染が発見されました。1974 年に、ソビエト連邦の 5 つのヒト細胞株が HeLa であることが判明しました。50 を超える細胞株を分析した追跡調査では、半数が HeLa マーカーを持っているものの、汚染 HeLa が元の細胞株とハイブリッド化していることが示されました。空気中の飛沫による HeLa 細胞の汚染も報告されています。1978年のワクチン試験では、ジョナス・ソークによって HeLa が知らず知らずのうちにヒトに注射されたことさえありました。 ^{[ 37 ]}

細胞は培養中に分裂を続けるため、一般的に利用可能な面積や体積を埋め尽くすように増殖します。これにより、いくつかの問題が生じる可能性があります。

• 培養培地中の栄養素の枯渇
• 培養培地のpHの変化
• アポトーシス細胞／壊死細胞（死細胞）の蓄積
• 細胞同士の接触は細胞周期の停止を刺激し、細胞分裂を停止させる。これは接触阻害として知られている。
• 細胞間の接触は細胞分化を促進する可能性がある。
• 遺伝的およびエピジェネティックな変化により、変化した細胞の自然選択が起こり、分化が低下し増殖能力が増加した異常な培養適応細胞の過剰増殖につながる可能性がある。^{[ 38 ]}

培養培地の選択は、栄養成分や濃度の違いにより、細胞培養実験の結果の生理学的関連性に影響を与える可能性がある。 ^{[ 39 ]}生成されたデータセットに系統的なバイアスがあることが、最近、CRISPRおよびRNAi遺伝子サイレンシングスクリーニング^{[ 40 ]} 、および癌細胞株の代謝プロファイリング^{[ 39 ]}で示された。生理学的レベルの栄養素をよりよく反映する増殖培地を使用することで、 in vitro研究の生理学的関連性を向上させることができ、最近では、Plasmax ^{[ 41 ]}やHuman Plasma Like Medium（HPLM）^{[ 42 ]}などの培地が開発された。

培養細胞に対して行われる一般的な操作には、培地交換、継代培養、細胞への遺伝子導入などがあります。これらは通常、無菌操作に基づく組織培養法を用いて行われます。無菌操作の目的は、細菌、酵母、または他の細胞株による汚染を避けることです。操作は通常、汚染微生物を排除するためにバイオセーフティキャビネットまたは層流キャビネット内で行われます。抗生物質（例：ペニシリン、ストレプトマイシン）や抗真菌剤（例：アムホテリシンB、抗生物質・抗真菌剤混合液）も培養培地に添加することができます。

細胞が代謝過程を経るにつれて酸が生成され、pHが低下する。栄養素の枯渇を測定するために、培地にpH指示薬が添加されることが多い。

ヒト由来の細胞株は、親生物よりも長生きし、後に収益性の高い医療治療法の発見に利用される可能性があるため、生命倫理においてやや議論の的となってきた。この分野における先駆的な判決として、カリフォルニア州最高裁判所は、ムーア対カリフォルニア大学評議員会事件において、ヒト患者は、本人の同意を得て摘出された臓器由来の細胞株に対して財産権を持たないと判示した。^{[ 43 ]}

正常細胞と不死化細胞株を融合させることは可能です。この方法はモノクローナル抗体の産生に用いられます。簡単に説明すると、免疫した動物の脾臓（または血液）から分離したリンパ球を不死化骨髄腫細胞株（B細胞系統）と融合させ、一次リンパ球の抗体特異性と骨髄腫の不死性を兼ね備えたハイブリドーマを作製します。選択培地（HAまたはHAT）を用いて未融合骨髄腫細胞を選別します。一次リンパ球は培養中に急速に死滅し、融合細胞のみが生存します。これらの細胞は、まずプールで、次に単一クローン化後に、必要な抗体産生についてスクリーニングされます。

細胞株は、特定の特性や特徴を持つ細胞を選択またはクローニングすることによって、初代培養または細胞株から派生します。細胞株は培養に適応した細胞ですが、細胞株とは異なり、分裂能力が有限です。不死化されていない細胞は、40～60回の集団倍加後に分裂を停止し^{[ 44 ]}、その後、増殖能力を失います（老化として知られる遺伝的に決定された事象）。^{[ 45 ]}

組織工学、幹細胞、分子生物学の研究では、主に平らなプラスチック皿上での細胞培養が行われています。この技術は二次元（2D）細胞培養として知られており、 1885年にヴィルヘルム・ルーがニワトリの胚の髄板の一部を切り取り、平らなガラス板上で数日間温かい生理食塩水に浸して培養したことから始まりました。ポリマー技術の進歩により、今日では2D細胞培養の標準的なプラスチック皿、一般にペトリ皿として知られるものが生まれました。ドイツの細菌学者ユリウス・リヒャルト・ペトリは、ロベルト・コッホの助手として働いていた際に、この発明を行ったと一般的に考えられています。今日では、さまざまな研究者が培養用の実験用フラスコ、円錐形容器、さらには使い捨てバイオリアクターで使用されるような使い捨てバッグも利用しています。

ペトリ皿以外にも、科学者たちは長年にわたり、コラーゲンやフィブリンなどの生物由来のマトリックス内で細胞を培養しており、近年ではポリアクリルアミドやPEGなどの合成ハイドロゲル上でも細胞を培養している。これは、従来の硬い基質では発現しない表現型を引き出すためである。マトリックスの剛性を制御することへの関心が高まっており^{[ 50 ]}、この概念は次のような分野での発見につながっている。

• 幹細胞の自己複製^{[ 51 ] [ 52 ]}
• 系統指定^{[ 53 ]}
• 癌細胞の表現型^{[ 54 ] [ 55 ] [ 56 ]}
• 線維症^{[ 57 ] [ 58 ]}
• 肝細胞機能^{[ 59 ] [ 60 ] [ 61 ]}
• 機械感覚^{[ 62 ] [ 63 ] [ 64 ]}

3 次元での細胞培養は「生物学の新しい次元」として宣伝されてきました。^{[ 65 ]}現在、細胞培養の実践は、2 次元での単一または複数の細胞構造のさまざまな組み合わせに基づいています。^{[ 66 ]}現在、創薬、癌生物学、再生医療、ナノ材料評価、基礎生命科学研究などの研究分野で 3D 細胞培養の使用が増加しています。^{[ 67 ] [ 68 ] [ 69 ]} 3D 細胞培養は、足場またはマトリックスを使用して、または足場なしで成長させることができます。足場ベースの培養は、無細胞 3D マトリックスまたは液体マトリックスを使用します。足場なしの方法は通常、懸濁液で生成されます。^{[ 70 ]}細胞を 3 次元で培養すると、遺伝子発現シグネチャに大きな変化が生じ、生理的状態にある組織を部分的に模倣することになります。 [ 75 ] 3D 細胞培養モデルでは、単層培養よりも生体内での細胞増殖に似た^{細胞増殖が}見^{られ、3つ}の^培養すべてが細胞増殖を維持することができました。^[ 76 ^] 3D 培養が開発されるにつれて、腫瘍モデルの設計や悪性形質転換および転移の研究に大きな可能性が見出され、3D 培養は変化、相互作用、細胞シグナル伝達を理解するための^{高度なツール}を^{提供できるように}なります^{。[ 77 ]}

細胞培養は、組織培養および組織工学の根幹を成す要素であり、体外での細胞増殖と維持の基礎を確立するものです。ヒト細胞培養の主な応用分野は幹細胞産業であり、間葉系幹細胞を分離、培養し、最適化された凍結保存法を用いて長期保存することで、解凍後も安定した分化能と免疫調節能を維持し、将来の応用に備えます。組織工学は、毎年数十万人の患者に対し、低コストの医療を劇的に改善する可能性を秘めています。

ポリオ、麻疹、おたふく風邪、風疹、水痘のワクチンは現在、細胞培養で製造されています。H5N1パンデミックの脅威のため、インフルエンザワクチンに細胞培養を使用する研究は米国政府によって資金提供されています。この分野の新しいアイデアには、ヒトアデノウイルス（一般的な風邪ウイルス）をベクターとして使用して作られたものなどの組換えDNAベースのワクチン^{[ 79 ] [ 80 ]や新しいアジュバント[ 81 ]}などがあります 。

共培養法は、プレート上または3Dマトリックス内で2種類以上の細胞間の細胞間相互作用を研究するために用いられる。異なる幹細胞の培養や免疫細胞の相互作用は、生体組織に類似したin vitroモデルで調査することができる。ほとんどの組織は複数の種類の細胞から構成されているため、それらの相互作用をより深く理解し、模倣組織を導入するためには、3D培養環境での相互作用を評価することが重要である。共培養には直接的および間接的な2種類がある。直接的相互作用では、細胞が同じ培養培地またはマトリックス内で直接接触しているのに対し、間接的相互作用では、シグナル伝達因子や可溶性因子が関与できる異なる環境が関与する。^{[ 15 ] [ 82 ]}

細胞間の相互作用における組織モデル内の細胞分化は、共培養システムを用いて癌腫瘍をシミュレートしたり、治療試験における薬剤の効果を評価したり、治療試験における薬剤の効果を研究したりするために利用できる。3Dモデルにおける共培養システムは、微小環境が細胞の生物学的組織を定義する場合、化学療法や内分泌療法に対する反応を予測することができる。

組織工学では、複数の細胞が直接相互作用する組織形成を生成するために共培養法が用いられる。^{[ 83 ]}

マイクロ流体技術は、通常ミクロン単位の流量でプロセスを実行できるシステムを開発したものです。マイクロ流体チップはラボオンチップとも呼ばれ、少量の反応物とスペースで連続的な手順と反応ステップを実行できます。このようなシステムは、適切な生物学的アッセイと高感度検出技術と組み合わせることで、個々の細胞や分子の識別と分離を可能にします。^{[ 84 ] [ 85 ]}

OoCシステムは、マイクロ流体で組織を培養することで細胞の微小環境を模倣し制御します。組織工学、生体材料製造、細胞生物学を組み合わせることで、実験室でヒト疾患を研究するための生体模倣モデルを確立する可能性を提供します。近年、3D細胞培養科学は著しい進歩を遂げ、OoCの開発につながりました。OoCは、医薬品研究、創薬、疾患モデリングに役立つ前臨床段階と考えられています。^{[ 86 ] [ 87 ]} OoCは、動物実験と臨床研究の間のギャップを埋めることができる重要な技術であり、科学の進歩により、薬物送達や病態生理学的研究のためのin vivo研究の代替となる可能性もあります。^{[ 88 ]}

植物細胞培養は、一般的に液体培地中の細胞懸濁培養、または固体培地中のカルス培養として行われる。未分化植物細胞およびカルスの培養には、植物成長ホルモンであるオーキシンとサイトカイニンの適切なバランスが必要である。

ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来の細胞（最も代表的なのはSchneider 2細胞）は、生のハエや幼虫では実施が難しい生化学的研究やsiRNAを用いた研究などの実験に使用できる。ヨトウムシ（Spodoptera frugiperda）由来の細胞株（Sf9およびSf21を含む）や、キャベツヨトウ（Trichoplusia ni）由来のHigh Five細胞は、バキュロウイルスを用いた組換えタンパク質の発現によく使用される。^{[ 91 ]}

細菌や酵母の場合、少量の細胞は通常、栄養素が埋め込まれた固体支持体（通常は寒天などのゲル）上で培養されるが、大規模な培養は、細胞を栄養培地に懸濁させて行われる。

ウイルスの培養には、ウイルスの増殖と複製のための宿主として、哺乳類、植物、真菌、または細菌由来の細胞培養が必要です。適切な条件下では、野生型ウイルス全体、組換えウイルス、またはウイルス産物を、本来の宿主以外の細胞種で生成することができます。ウイルスの種類によっては、感染とウイルス複製によって宿主細胞の溶解とウイルスプラークの形成が起こる場合があります。