3D細胞培養

3D細胞培養とは、生物細胞が3次元すべてにおいて周囲と成長または相互作用できる人工的に作られた環境のことです。2D環境（例えばペトリ皿）とは異なり、3D細胞培養では、細胞がin vivoと同様に、試験管内であらゆる方向に成長することができます。^{[ 1 ]}これらの3次元培養は通常、バイオリアクターと呼ばれる小さなカプセルで行われ、その中で細胞は球状体、つまり3D細胞コロニーに成長します。通常、1つのバイオリアクターあたり約300個の球状体が培養されます。^{[ 1 ]}

3D細胞培養は数十年にわたり研究に用いられてきた。^{[ 2 ]} 3D細胞培養の開発に関する最初の記録されたアプローチの1つは20世紀初頭で、アレクシス・カレルが長期にわたる体外組織培養法の開発に取り組んだことである。^{[ 3 ]} 1980年代の初期の研究では、ローレンス・バークレー国立研究所のミナ・ビッセルが主導し、正確な体外培養モデルを作成するための3D技術の重要性を強調した。この研究は、細胞外マトリックスの重要性と、人工3Dマトリックスでの培養が、健康な乳房組織モデルや癌性乳房組織モデルの腺房構造など、生理学的に関連する多細胞構造を生成する能力に焦点を当てた。これらの技術は、医薬品化合物に対する細胞応答を評価するために使用される体外疾患モデルに適用されている。^{[ 4 ]}

エリック・サイモンは、1988年のNIH SBIR助成金報告書で、電気紡糸法を用いてナノスケールおよびサブミクロンスケールのポリスチレンおよびポリカーボネート繊維マット（現在では足場として知られている）を製造できることを示し、これは特にin vitro細胞基質として使用することを目的としていた。細胞培養および組織工学における電気紡糸繊維格子のこの初期の使用により、ヒト包皮線維芽細胞（HFF）、形質転換ヒト癌（HEp-2）、ミンク肺上皮（MLE）などのさまざまな細胞タイプが繊維に付着し、その上で増殖することが示された。2D培養で一般的に見られる平坦な形態とは対照的に、電気紡糸繊維上で増殖した細胞は、一般的にin vivoで観察される組織学的に丸みを帯びた3次元形態を示したことが注目された。^{[ 5 ]}

3D細胞培養は、細胞と細胞外マトリックス間の相互作用を含む生体内環境の重要な側面を模倣することにより、正常組織または腫瘍の構造的構造と特殊な機能を実験室環境で忠実に再現することを可能にします。このアプローチは、生体組織の状態とプロセスを忠実にモデル化し、生体内で観察されるものと同様の反応を生み出します。1970年代に始まった3D細胞培養は、組織の恒常性と癌を制御するメカニズムに関する重要な洞察を提供してきました。^{[ 6 ]}さらに、癌生物学と組織工学の分野におけるトランスレーショナル研究を加速させてきました。^{[ 7 ]}現在まで、構築物のサイズを制限する主な要因は、壊死と呼ばれるプログラムされていない細胞死でした。^{[ 8 ]}

生体組織では、細胞は複雑な細胞間相互作用と細胞-マトリックス相互作用、および栄養素と細胞の複雑な輸送ダイナミクスを伴う 3D微小環境に存在します。 ^{[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [12][13][14][ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]標準的な2Dまたは単層細胞培養}は、この環境を適切に表現していないため、多くの場合、生体内での薬剤の有効性と毒性の信頼できる予測因子になりません^。 [ 18 ^{] [ 15 ] 3Dスフェロイド}は、細胞間のコミュニケーションと細胞外マトリックスの発達に関して、生体内の組織により近いものとなっています。^{[ 1 ]}これらのマトリックスは、細胞が生体組織内で移動するのと同様に、スフェロイド内で移動できるようにします。^{[ 11 ]}したがって、スフェロイドは、細胞の移動、分化、生存、および成長のための改良されたモデルです。^{[ 16 ]}さらに、3D細胞培養は細胞の極性をより正確に描写します。2Dでは細胞は部分的にしか極性化できないためです。^{[ 11 ]}また、3Dで培養された細胞は、2Dで培養された細胞とは異なる遺伝子発現を示します。^{[ 11 ]}

細胞成長の3次元は、機械的入力や細胞接着のための接触空間を増やし、インテグリン結合、細胞収縮、さらには細胞内シグナル伝達に必要となる。^{[ 19 ] [ 20 ]}通常の溶質拡散とエフェクタータンパク質（成長因子や酵素など）への結合も3D細胞マトリックスに依存しているため、組織スケールの溶質濃度勾配の確立に不可欠である。^{[ 21 ] [ 22 ]}

薬物毒性スクリーニングの目的においては、3D スフェロイドの遺伝子発現は生体内での遺伝子発現により近いものとなるため、2D で培養した細胞よりも 3D で培養した細胞の遺伝子発現を試験する方がはるかに有用である。最後に、3D 細胞培養は2D の細胞培養よりも安定性が高く、寿命も長い。 ^{[ 23 ]}これは、長期研究や薬物の長期効果の実証により適していることを意味する。3D 環境では、細胞は妨害されることなく成長することができる。2D では、細胞は正常な細胞成長に必要な栄養素を十分に得るために、定期的にトリプシン処理を受けなければならない。 ^{[ 24 ]} 3D スフェロイドは、健康で非癌性の成長を維持しながら、実験室環境で最長 302 日間培養されている。^{[ 23 ]}

生物学と航空宇宙の学際的研究において、3Dプリントされた足場は、打ち上げ時の重力の影響から細胞を保護するためにも使用されている。^{[ 25 ]}

市販されている培養ツールの中には、3D細胞培養の利点を提供すると謳っているものが数多く存在する。一般的に、これらのプラットフォームは、足場を用いる方法と足場を用いない方法という2種類の3D培養法に分類できる。

足場不要の技術

足場を用いない技術は、足場の使用とは独立した別のアプローチを採用しています。足場を用いない方法には、例えば、低接着プレート、ハンギングドロッププレート、マイクロパターン表面、回転式バイオリアクター、磁気浮上、磁気3Dバイオプリンティングなどが含まれます。

球状体

スフェロイドは、2 次元細胞モデルと比較して、生きた細胞の環境条件をよりよくシミュレートする 3 次元細胞モデルの一種であり、特に細胞間の反応と細胞とマトリックス間の反応がシミュレートされます。^{[ 38 ]}スフェロイド内の細胞と細胞外マトリックス間の強い相互作用により、透過性が制限され、スフェロイドを通して栄養素や酸素などの生理学的に関連する勾配が生成されます。^{[ 39 ]}スフェロイドは、細胞の生理学的特性の変化の研究、^{[ 40 ]}健康な細胞と腫瘍細胞の構造の違い、および腫瘍形成時に細胞が受ける変化の研究に役立ちます。^{[ 41 ]}腫瘍細胞と健康な細胞を共培養したスフェロイドは、癌細胞が正常細胞とどのように相互作用するかをシミュレートするために使用されました。 ^{[ 42 ]}スフェロイドは、腫瘍と間質の相互作用を模倣するために線維芽細胞と共培養することもできます。^{[ 43 ]}スフェロイドは、いくつかの異なる方法で成長させることができます。一般的な方法の 1 つは、細胞接着性の低いプレート (通常は 96 ウェル プレート) を使用してスフェロイド培養を大量生産することであり、凝集体は細胞プレートの丸い底に形成されます。^{[ 37 ] [ 44 ]}スフェロイドは、細胞プレートの表面から垂れ下がる液滴で細胞凝集体を形成するハンギング ドロップ法^{[ 45 ]}を使用して培養することもできます。^{[ 38 ]}研究中の他の方法には、回転壁容器バイオリアクターの使用があり、これは細胞が常に自由落下しているときに回転して培養され、凝集体が層状に形成されます^{[ 46 ]}最近では、均一で信頼性の高いスフェロイドを生産するためのいくつかのプロトコルが標準化されています。^{[ 47 ]}研究者は、3D 細胞培養のための標準化された、経済的で再現性のある方法も検討してきました。^{[ 48 ]}スフェロイド実験の再現性と透明性を向上させるために、国際コンソーシアムは MISpheroID (Minimal Information in Spheroid Identity) を開発しました。^{[ 49 ]}

クラスターロイド

クラスターロイドは、スフェロイドに似た三次元細胞モデリングの一種ですが、その作成方法が異なります。水-水中ピッカリングエマルジョンの水性二相系で細胞のクラスターとして成長させ、界面張力と浸透圧収縮を利用して細胞を密なクラスターに詰め込み、その後、ハイドロゲルで培養して組織またはオルガノイドにします。^{[ 50 ] [ 51 ]}

血管がない場合、壊死核形成中に酸素透過性が損なわれ、これが 3D 細胞培養の体外使用を妨げます。この問題を克服できるエマルジョン テンプレートがあります。このアプローチにより、研究者は細胞組成を調整して、共培養クラスターロイド内で多様な血管新生タンパク質マーカーの合成を促進する理想的な条件を達成することができました。^{[ 51 ]} HUVEC 細胞は、血管内皮増殖因子 (VEGF) や血管新生を誘導する他の薬剤を外部から導入することなく、マトリゲル内で内皮細胞の芽を生成することにより、Hep-G2 細胞とその誘導体の存在に反応します。^{[ 52 ] [ 53 ]}この培養技術の複製は、さまざまな細胞共培養スフェロイドを生成するために簡単です。^{[ 54 ]} w/w ピッカリング エマルジョン テンプレートは、3D 共培養モデルの構築に大いに役立ち、薬物試験や組織工学への応用に大きな可能性を提供します。^{[ 55 ]}

バイオリアクター

3D細胞培養に使用されるバイオリアクターは、細胞を3次元で培養するために特別に設計された小型のプラスチック製円筒形チャンバーです。バイオリアクターは、ポリエチレンテレフタレート膜などの生物活性合成材料を使用して、高レベルの栄養素を維持する環境で球状細胞を囲みます。^{[ 56 ] [ 57 ]}開閉が容易なので、細胞球状体を取り出して試験することができますが、チャンバー全体で100%の湿度を維持できます。^{[ 1 ]}この湿度は、細胞の成長と機能を最大限に高めるために重要です。バイオリアクターチャンバーは、3次元全体で各方向に均等に細胞が成長するように回転する大型装置の一部です。^{[ 1 ]} MC2 Biotekは、ガス交換を使用して細胞チャンバー内の高酸素レベルを維持するプロト組織培養用バイオリアクターを開発しました。^{[ 58 ]}これは、酸素レベルが高いと細胞の成長と正常な細胞呼吸が促進されるため、従来のバイオリアクターよりも優れています。^{[ 16 ]}

組織工学（TE）企業、学術機関、および産業パートナー間の協力により、研究指向のバイオリアクターを効率的な商業製造システムへと変革することが可能になります。^{[ 59 ]}学術協力者は基礎的な側面を提供し、産業パートナーは必須の自動化要素を提供することで、規制基準への準拠と使いやすさを確保します。^{[ 60 ]} REMEDI、AUTOBONE、STEPSなどのヨーロッパの確立されたコンソーシアムは、自家細胞ベースの移植片のエンジニアリングを合理化するための自動化システムの開発に重点を置いています。^{[ 61 ]}目標は、規制基準を満たし、費用対効果を確保し、組織工学製品を臨床的に利用しやすくし、TEのトランスレーショナルパラダイムを研究から競争力のある商業分野へと進めることです。^{[ 62 ]}

マイクロ流体技術の利用により、複雑な微細構造の生成とパラメーターの精密な操作が容易になり、生体内の細胞環境を模倣することができます。マイクロ流体技術と3D細胞培養の統合は、生体内の組織特性を再現しようとするアプリケーションに大きな可能性を秘めており、特に進化しているオルガンオンチップシステムに代表されます。^{[ 63 ]} 人体のさまざまな細胞構造は、生存するために栄養素とガス交換を受け取るために血管化されている必要があります。同様に、in vitroでの3D細胞培養には一定レベルの流体循環が必要ですが、細胞がすべて十分な栄養素に曝露されない可能性がある高密度の3D培養では問題となる可能性があります。肝臓は高度に血管化された臓器であるため、これは肝細胞培養で特に重要です。ある研究では、マイクロ流体チャネル間のコラーゲンゲル足場上で肝細胞と血管細胞を一緒に培養し、静的環境と流動環境における細胞の成長を比較し、組織と微小血管ネットワークを備えたモデルの必要性を示しました。^{[ 64 ]}別の研究では、ハンギングドロップベースのスフェロイド共培養デバイスが有用であることが示されており、マイクロ流体ハンギングドロップデバイスの隣接するチャネル上に2つの異なる細胞スフェロイドを生成し、融合する液滴でスフェロイドを共培養して、腫瘍誘発血管新生をモニタリングすることができる。^{[ 65 ]}

マイクロ流体3D細胞培養は、生物医学研究や組織工学への応用が期待される分野として注目を集めている。しかし、その発展にはいくつかの大きな課題が伴う。^{[ 66 ]}そのような課題の一つは、マイクロシステム内で培養細胞にアクセスするのが難しいことと、その後のアッセイのためのサンプル抽出が複雑であることである。^{[ 67 ]}さらに、生体内のような細胞代謝や機能の研究、創薬に特化した方法論やデバイスの開発は、マイクロ流体3D細胞培養デバイスにとって大きな障害となっている。^{[ 68 ]}もう一つの注目すべき障害は、従来の生物学研究室ではマイクロファブリケーション機器の利用が限られていることである。さらに、成熟した使いやすいマイクロ流体デバイスの商業化は大きな課題であり、生物学者にとっての利用を妨げている。^{[ 69 ]}最後に、生物学者は最適な再現性を備えたハイスループットアッセイツールを求めることが多いが、マイクロ流体技術は並列アッセイの潜在的な実現可能性にもかかわらず、これらの要求を満たす上で技術的な限界に直面している。^{[ 70 ]}

高密度フォーマットでのハイスループットスクリーニング用の 3D モデルの高度な開発は、マイクロプレート密度の増加に関連する技術的成果により、最近実現可能になりました。これらは、細胞をはじき、費用対効果が高く、完全自動化スクリーニングプラットフォームに適した 384 ウェルおよび 1536 ウェルフォーマットで見つけることができます。 ^{[ 71 ]} 1536 ウェルフォーマットを実現する 2 つのオプションは、m3D磁気 3D バイオプリンティングを使用する Greiner Bio-One ^{[ 72 ]}と、超低付着表面コーティング、マイクロキャビティ形状、重力を組み合わせて 3D モデルを作成する Corning Life Sciences から提供されています。^{[ 73 ] [ 74 ]} 3D スクリーニング用に開発された迅速かつ手頃な価格の方法と技術により、癌遺伝子関連の変異体と野生型の同質遺伝子ペアをテストするための並列ハイスループットスクリーニングアプローチが可能になりました。^{[ 75 ]}さらに、ハイスループットスクリーニング技術は、3D細胞培養の枠組みの中で薬理学と毒性学の領域を結びつける上で極めて重要な役割を果たします。

3D 足場および 3D 細胞スフェロイドとして細胞を試験管内で培養する主な目的は、前臨床試験で薬物およびナノ材料の薬物動態および薬力学的効果をテストすることです。 ^{[ 16 ] [ 76 ] [ 77 ] [ 78 ] [ 79 ]}毒性研究では、薬物化合物の毒性をテストする目的で、3D 細胞培養が in vivo 研究とほぼ同等であることが示されています。アセトアミノフェン、アミオダロン、ジクロフェナク、メトホルミン、フェンホルミン、およびバルプロ酸の6 つの一般的な薬物のLD ₅₀値を比較すると、3D スフェロイドの値は in vivo 研究の値と直接相関していました。^{[ 80 ]} 2D細胞培養はこれまで生体内試験とともに毒性試験に用いられてきたが、3Dスフェロイドは寿命が長いため慢性曝露毒性試験に適している。^{[ 81 ]} 3Dスフェロイドのマトリックスは細胞にアクチンフィラメントを維持させ、ヒト細胞の細胞骨格組織、細胞極性、形状において生理学的により関連性が高い。^{[ 82 ]} 3次元配置により、動物実験を用いずに生体内のヒト組織により正確に類似したモデルを培養物で提供できる。^{[ 83 ]}

薬剤候補の評価および毒性評価に関する現在のプロトコルは、初期段階のin vitro細胞ベースアッセイから得られる結果に大きく依存しており、これらのアッセイがin vivo薬理学および毒性学の重要な側面を忠実に捉えることが期待されている。^{[ 84 ]}さまざまなin vitro設計がハイスループット用に微調整され、スクリーニング効率が向上し、薬理学的に関連する可能性のある分子または潜在的に毒性のある分子の網羅的なライブラリが、組織損傷を示す細胞シグナルまたは治療目標に沿った細胞シグナルについて精査されるようになっている。^{[ 85 ]}特定の細胞タイプ、シグナル伝達経路、およびレポーターの選択を含む、マルチプレックス細胞ベースアッセイ設計への革新的なアプローチが標準的な慣行となっている。^{[ 86 ]}

これらの進歩にもかかわらず、新規化学物質および生物学的物質（NCE/NBE）のかなりの割合が、後期段階のヒト薬物試験で挫折を経験している。規制当局から「ブラックボックス」警告を受けるものもあれば、規制当局の承認後に安全性の懸念から市場から撤退するものもある。^{[ 87 ]}この繰り返されるパターンは、in vitro細胞ベースのアッセイとそれに続く前臨床in vivo試験が、包括的な薬理学的および毒性データ、あるいは薬物候補のin vivo性能を理解するための信頼できる予測能力を提供するには不十分であることを強調している。^{[ 88 ]}

薬理学および毒性学のための信頼できる翻訳アッセイツールキットがないことが、初期のin vitro細胞ベーススクリーニングからin vivo試験およびその後の臨床承認への移行の高コストと非効率性の一因となっている。^{[ 89 ]}特に、必須の細胞および分子相互作用、ならびに細胞表現型および生物活性物質への反応に影響を与える生理学的パラメーターを保持する能力に重点が置かれている。これらのモデルに関連する独特の利点と課題が精査され、細胞ベースアッセイへの適合性および薬物毒性のin vivoメカニズムとの正確な相関関係を確立するために重要な予測能力に特に焦点が当てられている。^{[ 90 ]}

安全性と有効性を評価する際、これらのモデルは幅広い疾患状態をモデル化するのに適しています。これらのモデルにはそれぞれ利点と限界があり、モデル開発とデータ解釈が必要です。官民連携は、この分野の研究を進展させ、促進するために不可欠です。^{[ 91 ]}

既存の3D法には、拡張性、再現性、感度、ハイスループットスクリーニング（HTS）機器との互換性など、いくつかの限界がある。細胞ベースのHTSは、用量依存的な細胞生存率、細胞間/細胞-マトリックス相互作用、細胞遊走など、薬物相互作用に対する細胞応答の迅速な判定に依存しているが、利用可能なアッセイは3D細胞培養に最適化されていない。3D細胞培養が直面するもう1つの課題は、これらの3D環境における薬物相互作用、細胞分化、細胞シグナル伝達のメカニズムと相関関係を扱ったデータと論文が限られていることである。3D法は、創薬プロセスを含め、大規模に2D培養に取って代わるまでにはまだ至っていない。3D細胞培養に関する論文数は急速に増加しているものの、現在の3D組織の生化学的特性評価が限られているため、新しい方法の採用が阻害されている。

スフェロイドを癌組織のモデルとして使用することにも問題があります。3D 組織培養には有益ですが、腫瘍スフェロイドは、Ratmir らによって検討された組織ベースのバイオアッセイ用の紙支持型 3D 細胞培養とは異なり、「[3D スフェロイド] 構造体内の可溶性分子の勾配を操作し、これらの複雑な勾配内の細胞を特徴付ける」ことが困難または不可能であると批判されています。^{[ 57 ]}複雑な 3D 細胞培養技術に関連するその他の課題には、大きな足場サイズと多くの蛍光顕微鏡との互換性がないためにイメージングが困難であること、スフェロイドを単一細胞懸濁液に解離する必要があるためフローサイトメトリーが困難であること、および液体処理の自動化などがあります。^{[ 92 ]}

組織工学には3D細胞足場が必要です。生体材料として、科学者たちは3D足場の設計に様々な天然および合成ポリマーハイドロゲルを使用してきました。このバリアは天然のECM微小環境を模倣した構造であるため、合成足場は特定の腫瘍形成段階の研究により有用である可能性があります。^{[ 36 ]}最後に、特定のターゲットに応じて最も適切な3次元モデルを慎重に選択する必要があると示唆されています。^{[ 93 ]}

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