ヘキスト染色

ヘキスト染色液は、DNA を染色するために使用される青色蛍光色素のファミリーの一部です。^{[ 1 ] [ 2 ]}これらのビスベンズイミドは、もともとヘキスト AGによって開発され、同社はすべての化合物に番号を付けており、ヘキスト 33342は同社が製造した 33,342 番目の化合物です。関連するヘキスト染色液は、ヘキスト 33258、ヘキスト 33342、およびヘキスト 34580 の 3 つです。ヘキスト 33258 とヘキスト 33342 は最も一般的に使用されている色素で、同様の励起-発​​光スペクトルを持っています。

両方の色素は、約 350 nmの紫外線で励起され、両方とも、461 nm付近の発光スペクトル最大値付近で青シアンの蛍光を発します。結合していない色素は、510～540 nm の範囲で最大の蛍光発光を示します。Hoechst 色素は、キセノンランプ、水銀アークランプ、または紫外線レーザーで励起できます。励起スペクトルと発光スペクトルの間にはかなりのストークスシフトがあるため、Hoechst 色素は、複数の蛍光色素を使用する実験で有用です。Hoechst 色素の蛍光強度は、溶媒のpHとともに増加します。^{[ 3 ]}   

ヘキスト染料は水やジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解します。濃度は最大10 mg/mLまで可能です。水溶液は、光を遮断すれば2～6℃で少なくとも6か月間安定です。長期保存の場合は、溶液を-20 ℃以下で凍結します。^{[ 3 ]}   

色素は二本鎖DNAのマイナーグルーブに結合し、アデニンとチミンに富む配列を優先的に結合します。色素はすべての核酸に結合できますが、ATに富む二本鎖DNA鎖は蛍光を著しく増強します。^{[ 4 ]} Hoechst色素は細胞透過性があり、生細胞または固定細胞のDNAに結合できます。そのため、これらの染色剤はしばしば超生体染色剤と呼ばれ、生細胞がこれらの化合物による処理に耐えられることを意味します。特定のATP結合カセットトランスポータータンパク質を発現する細胞は、これらの染色剤を細胞質から能動的に輸送することもできます。

細菌や真核細胞のDNAを染色するには、0.1～12 μg/mlの濃度 が一般的に使用されます。細胞は室温または37 ℃で1～30分間染色され、その後、未結合の色素を除去するために洗浄されます。色素が多すぎる場合や、洗浄が不十分なサンプルでは、​​未結合のHoechst色素の緑色の蛍光が観察されることがあります。^{[ 3 ]} Hoechst色素は、 DAPIと呼ばれる別の核酸染色剤の代替としてよく使用されます。 

ヘキスト色素とDAPIの主な違いは以下のとおりです。

• ヘキスト色素はDAPIよりも毒性が低いため、染色された細胞の生存率が高くなる。^{[ 5 ]}
• 特定のヘキスト色素（ヘキスト33342）に含まれる追加のエチル基は、細胞透過性を高める。^{[ 6 ]}
• 染色後も細胞の生存能力を維持できる核染色色素が存在する。

Hoechst 33342 と 33258 は、分裂細胞の検出によく用いられるブロモデオキシウリジン(BrdU)によって消光されます。Hoechst 33342 は、H 33258 よりも 10 倍高い細胞透過性を示します。細胞は、チミジンの代わりに新しく合成された DNA に BrdU を取り込むことができます。BrdU が DNA に組み込まれると、臭素がマイナーグルーブを変形させ、Hoechst 色素が最適な結合部位に到達できなくなると考えられています。Hoechst 色素は、BrdU と併用して細胞周期の進行をモニターするために使用できます。^{[ 7 ] [ 8 ]}

ヘキスト色素は、ゲノムDNAの染色に一般的に以下の用途で使用されます。

• 蛍光顕微鏡検査および免疫組織化学、多くの場合他の蛍光色素とともに^{[ 9 ]}
• フローサイトメトリーは細胞を数えたり分類したりするために使用されます。例としては、Hoechst色素を使用して、集団内の細胞が細胞周期のどの段階にあるかを分析する方法があります^{[ 10 ]。}
• アガロースゲル中のRNA存在下でのDNAの検出^{[ 11 ]}
• 自動DNA判定^{[ 12 ]}
• 染色体選別^{[ 11 ]}

ヘキスト色素の流出は、造血幹細胞や胚性幹細胞の研究にも利用されます。これらの細胞は色素を効率的に流出させることができるため、フローサイトメトリーによって「サイドポピュレーション」と呼ばれる集団として検出できます。これは、励起されたヘキスト色素から放出される蛍光を赤色フィルターと青色フィルターの両方に通し、ヘキスト色素の赤色と青色を互いにプロットすることによって行われます。

ヘキスト染色液はDNAに結合するため、細胞分裂中のDNA複製を阻害します。したがって、変異原性および発がん性がある可能性があり、取り扱いと廃棄には注意が必要です。ヘキスト染色液は、家畜や人間の精子の選別に使用されます。その安全性については議論があります。^{[ 13 ] [ 14 ]}

• 蛍光色素のスペクトルトレース
• ヘキスト染色法マニュアル
• 蛍光プローブと市販の標識技術に関するオンラインガイド