ハイブリドーマ技術

ハイブリドーマ技術は、モノクローナル抗体とも呼ばれる、同一の抗体を大量に生産する方法です。このプロセスは、免疫反応を誘発する抗原をマウス（または他の哺乳動物）に注入することから始まります。白血球の一種であるB 細胞は、注入された抗原に結合する抗体を生成します。次に、これらの抗体産生 B 細胞をマウスから採取し、不死化骨髄腫癌細胞と融合させて、 B 細胞の抗体産生能力と骨髄腫の寿命および増殖性の両方を備えたハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞株を生成します。

ハイブリドーマは培養で増殖させることができ、各培養は 1 つの生存ハイブリドーマ細胞から始まり、各培養は遺伝的に同一のハイブリドーマで構成され、培養ごとに異なる抗体の混合物 (ポリクローナル) ではなく 1 つの抗体 (モノクローナル) を生成します。このプロセスで使用される骨髄腫細胞株は、組織培養で増殖する能力と抗体合成がないことを理由に選択されます。多くの異なる抗体分子の混合物であるポリクローナル抗体とは対照的に、各ハイブリドーマ株によって生成されるモノクローナル抗体はすべて化学的に同一です。

モノクローナル抗体の生産は、 1975年にセザール・ミルシュタインとジョルジュ・JF・ケーラーによって発明されました。彼らは、免疫学に他の貢献をしたニールス・カイ・イェルネとともに、1984年のノーベル医学生理学賞を受賞しました。ハイブリドーマという用語は、 1976年から1977年にかけてセザール・ミルシュタインの研究室で研究休暇を取っていたレナード・ヘルツェンベルグによって造られました。^[1]

実験動物（哺乳類、例えばマウス）は、まず抗体を生成する抗原にさらされます。通常、これは数週間にわたって問題の抗原を数回注射することによって行われます。これらの注射の後には通常、免疫応答を大幅に強化する生体内電気穿孔法が使用されます。哺乳類の脾臓から脾臓細胞が分離されると、B細胞が不死化骨髄腫細胞と融合されます。B細胞と骨髄腫細胞の融合は電気融合を使用して行うことができます。 電気融合により、電場を印加することでB細胞と骨髄腫細胞が整列して融合します。あるいは、B細胞と骨髄腫は化学的プロトコルによって融合させることができ、最もよく使用されるのはポリエチレングリコールです。骨髄腫細胞は、抗体を分泌しないこと、およびヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT) 遺伝子を欠いていることを確認するために事前に選択され、 HAT 培地に対して感受性 (または脆弱) になります(以下を参照)。

融合細胞は、HAT 培地 (ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地) で約 10 ～ 14 日間培養されます。アミノプテリンは、ヌクレオチド合成を可能にする経路をブロックします。そのため、融合していない骨髄腫細胞は、 HGPRT が欠如しているため、 de novo経路またはsalvage 経路によってヌクレオチドを生成できず、死滅します。融合していない骨髄腫細胞は、特に弱く確立されたハイブリドーマの場合、他の細胞よりも増殖する可能性があるため、除去する必要があります。融合していない B 細胞は寿命が短いため、死滅します。このようにして、B 細胞由来の HGPRT 遺伝子が機能するため、B 細胞と骨髄腫のハイブリッドのみが生き残ります。これらの細胞は抗体を生成し (B 細胞の特性)、不死です (骨髄腫細胞の特性)。次に、培養した培地を、各ウェルに 1 つの細胞のみが含まれる程度までマルチウェル プレートに希釈します。ウェル内の抗体は同じ B 細胞によって生成されるため、同じエピトープに向けられ、モノクローナル抗体となります。

次の段階は迅速な一次スクリーニングプロセスであり、適切な特異性の抗体を産生するハイブリドーマのみを識別して選択します。最初に使用されるスクリーニング技術は、ELISAと呼ばれます。ハイブリドーマ培養上清、二次酵素標識複合体、および発色基質をインキュベートし、色のついた生成物の形成によりハイブリドーマが陽性であることを示します。あるいは、免疫細胞化学、^[2] ウエスタンブロット、および免疫沈降質量分析法があります。ウエスタンブロットアッセイとは異なり、免疫沈降質量分析法では、抗原タンパク質のネイティブ（非変性）形態に結合するクローンのスクリーニングとランク付けが容易になります。^[3]フローサイトメトリースクリーニングは、細胞表面上の抗原のネイティブ形態を認識する多数（約1000）のハイブリドーマクローンの一次スクリーニングに使用されています。^[4]フローサイトメトリーベースのスクリーニングでは、抗原陰性細胞と抗原陽性細胞の混合物が、各ハイブリドーマ上清サンプルの検査対象抗原として使用されます。^[4]

目的の抗体を産生するB細胞はクローン化され、多数の同一の娘クローンを産生することができる。このステップでは、インターロイキン-6（ブリクロンなど）を含む補助培地が不可欠である。ハイブリドーマコロニーが確立されると、RPMI-1640（抗生物質とウシ胎児血清を含む）などの培地で継続的に増殖し、抗体を産生する。^[2]

マルチウェルプレートは、ハイブリドーマを増殖させるために最初に使用され、選択後にはより大きな組織培養フラスコに変更されます。これにより、ハイブリドーマの健康が維持され、凍結保存とその後の調査のための上清に十分な細胞が提供されます。培養上清からは1～60μg/mlのモノクローナル抗体が得られ、必要になるまで-20℃以下に維持されます。^[2]

培養上清または精製免疫グロブリン製剤を使用することで、反応性、特異性、交差反応性の観点から、潜在的なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのさらなる分析を行うことができます。^[2]

モノクローナル抗体の用途は多岐にわたり、病気の予防、診断、治療に用いられます。例えば、モノクローナル抗体は B 細胞とT 細胞のサブセットを区別することができ、これはさまざまな種類の白血病の特定に役立ちます。さらに、特異的モノクローナル抗体は白血球やその他の細胞タイプの細胞表面マーカーを定義するために使用されてきました。これにより、分化マーカーのクラスターシリーズが生まれました。これらは CD マーカーと呼ばれることが多く、細胞の数百の異なる細胞表面成分を定義し、それぞれが特定のモノクローナル抗体の結合によって指定されます。このような抗体は、特定の種類の細胞を特異的に分離する蛍光活性化細胞選別に極めて有用です。

モノクローナル抗体の助けを借りて、組織や臓器は、組織または細胞の発生を反映する特定のマーカーの発現に基づいて分類することができます。前立腺特異抗原、胎盤アルカリホスファターゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α-フェトプロテインなどは臓器関連抗原であり、これらの抗原に対するモノクローナル抗体の産生は、原発性腫瘍の性質を決定するのに役立ちます。^[2]

モノクローナル抗体は、胸膜中皮腫や腹膜中皮腫、腺癌などの形態学的に類似した病変を区別したり、未分化転移の臓器や組織の起源を特定したりするのに特に有用である。選択されたモノクローナル抗体は、骨髄、その他の組織吸引物、リンパ節、その他の組織の免疫細胞学的分析による潜在性転移（原発巣不明の癌）の検出に役立ち、通常の組織病理学的染色よりも感度が高くなります。^[2]

ある研究^{[5]では、限局性前立腺がん患者 20 名の}骨髄穿刺液に対して高感度の免疫組織化学分析を行った。上皮細胞が発現する膜抗原と細胞骨格抗原を認識して腫瘍細胞を検出できる 3 種類のモノクローナル抗体 (T16、C26、AE-1) をこの分析に使用した。限局性前立腺がん患者の 22% (ステージ B、0/5、ステージ C、2/4)、および転移性前立腺がん患者の 36% (ステージ D1、0/7、ステージ D2、4/4) の骨髄穿刺液で骨髄中に抗原陽性細胞が認められた。明らかに限局性前立腺がん患者の潜在性骨髄転移を検出するには、骨髄穿刺液の免疫組織化学染色が非常に有用であると結論付けられた。

腫瘍関連モノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学は、骨髄穿刺液や末梢血中の潜在性乳がん細胞の検出能力を向上させたが、この方法が日常的に使用されるようになるにはさらなる開発が必要である。 ^[6]免疫細胞化学の大きな欠点の1つは、腫瘍関連モノクローナル抗体のみが使用され、腫瘍特異的モノクローナル抗体が使用されないことであり、その結果、正常細胞との交差反応が起こる可能性がある。^[7]

乳がんのステージを効果的に判定し、自家幹細胞注入前の除去療法の有効性を評価するためには、たとえ少量の乳がん細胞であっても検出することが重要です。免疫組織化学的方法は、単純で感度が高く、非常に特異的であるため、この目的に最適です。Franklin ら^[8]は、腫瘍細胞表面糖タンパク質に対する 4 つのモノクローナル抗体 (260F9、520C9、317G5、BrE-3) の組み合わせを使用して、骨髄と末梢血中の乳がん細胞を同定する感度の高い免疫細胞化学アッセイを実施しました。彼らは結果から、骨髄と末梢血の免疫細胞化学染色は、乳がん細胞を検出し定量化する感度の高い簡単な方法であると結論付けました。

固形腫瘍患者における転移再発の主な原因の 1 つは、悪性細胞の早期拡散です。サイトケラチンに特異的なモノクローナル抗体 (mAbs) を使用すると、骨髄に拡散した個々の上皮性腫瘍細胞を特定できます。

ある研究^[9] では、サイトケラチン成分 18 (CK18) と前立腺特異抗原(PSA) を同時に標識する免疫細胞化学法の開発が報告されています。この方法は、前立腺がん患者の個々の分散性上皮性腫瘍細胞のさらなる特徴付けに役立ちます。良性前立腺肥大症患者の 12 個の対照吸引液は陰性染色を示し、骨髄中の上皮性腫瘍細胞を検出する CK18 の特異性をさらに裏付けています。

滲出液を伴う悪性疾患のほとんどの症例では、腫瘍細胞は容易に認識できます。しかし、悪性細胞が容易に確認できない、またはその存在が疑わしいため陽性報告と呼べない症例もあります。このような症例では、免疫細胞化学技術を使用することで診断精度が向上します。

Ghosh、Mason、Spriggs ^[10]は 、悪性疾患の患者41人から採取した胸水または腹水53サンプルを分析した。従来の細胞学的検査では腫瘍細胞は発見されなかった。悪性細胞の検索には、3種類のモノクローナル抗体（抗CEA、Ca 1、HMFG-2）が使用された。-20℃で最大18か月保存されていた未染色塗抹標本に対して免疫細胞化学標識を実施した。免疫細胞化学染色を実施した41例中12例で悪性細胞が発見された。この結果は、診断精度が約20%向上したことを示している。この研究では、悪性疾患が疑われる患者では、細胞学的に陰性のサンプルの検査に免疫細胞化学標識を日常的に使用すべきであり、患者管理に関して重要な意味を持つと結論付けられた。

免疫細胞化学染色のもう一つの応用は、同じ塗抹標本中の2つの抗原の検出である。軽鎖抗体とT細胞マーカーおよびB細胞マーカーによる二重染色は、リンパ腫の腫瘍起源を示すことができる。^[11]

ある研究では、モノクローナル抗体（IgM、kアイソタイプ）を産生するハイブリドーマ細胞株（クローン1E10）の分離が報告されている。このモノクローナル抗体は、核小体の特異的免疫細胞化学染色を示す。^[12]

組織や腫瘍は、モノクローナル抗体の助けを借りて、特定のマーカーの発現に基づいて分類できます。モノクローナル抗体は、形態学的に類似した病変を区別し、未分化転移の臓器または組織起源を決定するのに役立ちます。選択されたモノクローナル抗体を使用した骨髄、組織吸引物、リンパ節などの免疫細胞学的分析は、潜在性転移の検出に役立ちます。モノクローナル抗体は、少量の侵襲性または転移性細胞を検出する感度を高めます。サイトケラチンに特異的なモノクローナル抗体 (mAbs) は、骨髄内の分散した個々の上皮性腫瘍細胞を検出できます。

• 米国国立医学図書館の医学件名標目(MeSH)にあるハイブリドーマ
• 「ハイブリドーマ技術」。がんを理解するシリーズ：免疫システム。国立がん研究所。2014年10月5日時点のオリジナルよりアーカイブ。
• 「ハイブリドーマ細胞培養」。2018年2月20日時点のオリジナルよりアーカイブ。2017年9月28日閲覧。