共焦点顕微鏡

共焦点顕微鏡法は、最も一般的には共焦点レーザー走査顕微鏡法（CLSM）またはレーザー走査共焦点顕微鏡法（LSCM）と呼ばれ、空間ピンホールを使用して画像形成時に焦点が合っていない光を遮断することにより、顕微鏡写真の光学解像度とコントラストを向上させる光学画像化技術です。 ^[1]サンプル内の異なる深さで複数の2次元画像をキャプチャすると、オブジェクト内の3次元構造を再構築できます（光学セクショニングと呼ばれるプロセス）。この技術は科学界と産業界で広く使用されており、典型的な用途は生命科学、半導体検査、材料科学です。

従来の顕微鏡では、光はサンプルを透過できる限り深くまで進みますが、共焦点顕微鏡では、一度に 1 つの狭い深さレベルに小さな光線を集中させるだけです。CLSM は、制御された非常に限定された被写界深度を実現します。

共焦点イメージングの原理は、1957年にマービン・ミンスキー氏によって特許取得されており^[2]、従来の広視野蛍光顕微鏡のいくつかの限界を克服することを目的としています。^[3]従来の（すなわち広視野）蛍光顕微鏡では、光源からの光が標本全体に均等に照射されます。標本のすべての部分は同時に励起され、その結果生じる蛍光は、大きな焦点の合っていない背景部分を含めて顕微鏡の光検出器またはカメラによって検出されます。対照的に、共焦点顕微鏡は、点照明（点像分布関数を参照）と、検出器の前の光学的に共役な面にあるピンホールを使用して、焦点外の信号を排除します。「共焦点」という名前はこの構成に由来しています。焦点面に非常に近い蛍光によって生成された光のみを検出できるため、特に標本の深さ方向における画像の光学解像度は、広視野顕微鏡よりもはるかに優れています。しかし、サンプルの蛍光からの光の多くはピンホールで遮断されるため、解像度が向上すると信号強度が低下し、長時間の露出が必要になることがよくあります。ピンホール後の信号の低下を補うために、光強度は高感度検出器（通常は光電子増倍管（PMT）またはアバランシェフォトダイオード）で検出され、光信号が電気信号に変換されます。^[4]

一度にサンプルの 1 点のみが照射されるため、2D または 3D イメージングでは、サンプル内の規則的なラスター (つまり、平行な走査線の長方形パターン) をスキャンする必要があります。ビームは、1 つ以上の (サーボ制御の) 振動ミラーを使用して、水平面でサンプル全体をスキャンします。このスキャン方法は、通常、反応待ち時間が短く、スキャン速度を変えることができます。スキャン速度が遅いほど、信号対雑音比が向上し、コントラストが向上します。

焦点面の達成可能な厚さは、主に、使用される光の波長を対物レンズの開口数で割った値によって決まりますが、試料の光学特性によっても決まります。薄い光学的断面が可能なため、このタイプの顕微鏡は、試料の 3D イメージングや表面プロファイリングに特に適しています。

連続したスライスは「Zスタック」を構成し、これを処理して3D画像を作成することも、2Dスタックにマージすることもできます（主に最大ピクセル強度が取得されますが、他の一般的な方法としては、標準偏差の使用やピクセルの合計などがあります）。^[1]

共焦点顕微鏡は、最小限のサンプル準備で、無傷で厚い生きた標本を直接、非侵襲的に連続的に光学切断する機能を提供するとともに、広視野顕微鏡と比較して横方向の解像度がわずかに向上します。^{[4]生物学的サンプルは、選択された物体を可視化するために}蛍光染料で処理されることがよくあります。しかし、生物学的システムへの妨害を最小限に抑えるために、実際の染料濃度は低くすることができます。一部の機器は単一の蛍光分子を追跡できます。また、遺伝子組み換え技術により、独自の蛍光キメラ分子（緑色蛍光タンパク質であるGFPと目的のタンパク質の融合など）を生成する生物を作成することもできます。共焦点顕微鏡は、標本内の点励起（回折限界スポット）と、結果として生じる蛍光信号の点検出の原理で機能します。検出器のピンホールは、焦点外の蛍光をブロックする物理的な障壁となります。焦点が合った、つまりエアリーディスクの中央のスポットのみが記録されます。

市販されている共焦点顕微鏡には次の 4 種類があります。

共焦点レーザー走査顕微鏡は、複数のミラー (通常、x 軸と y 軸に沿って直線的に走査する 2 つまたは 3 つ) を使用して、サンプル全体にレーザーを走査し、固定されたピンホールと検出器全体で画像を「デスキャン」します。このプロセスは通常、時間がかかり、ライブ イメージングには適していませんが、固定されたサンプルの高解像度の代表的な画像を作成するのに役立ちます。

回転ディスク(ニポウ ディスク) 共焦点顕微鏡は、ディスク上の一連の移動するピンホールを使用して光のスポットをスキャンします。一連のピンホールが領域を並行してスキャンするため、各ピンホールは特定の領域上に長時間留まることができ、レーザー走査顕微鏡と比較するとサンプルを照射するために必要な励起エネルギーが減少します。励起エネルギーが減少するとサンプルの光毒性と光退色が減少するため、多くの場合、生きた細胞や生物を画像化するのに適したシステムになります。

マイクロレンズ強化型またはデュアル回転ディスク型共焦点顕微鏡は、回転ディスク型共焦点顕微鏡と同じ原理で動作しますが、ピンホールを含む回転ディスクの前にマイクロレンズを含む第 2 の回転ディスクが配置されています。すべてのピンホールにはマイクロレンズが付いています。マイクロレンズは、広い帯域の光を捉えて各ピンホールに焦点を合わせるため、各ピンホールに向けられる光の量が大幅に増加し、回転ディスクによって遮断される光の量が減少します。そのため、マイクロレンズ強化型共焦点顕微鏡は、標準的な回転ディスク型システムよりも大幅に感度が高くなります。横河電機は1992 年にこの技術を発明しました。^[5]

プログラム可能アレイ顕微鏡 (PAM) は、電子制御の空間光変調器(SLM) を使用して、一連の可動ピンホールを生成します。SLM は、電子的に調整可能な個々のピクセルの特性 (不透明度、反射率、または光学回転) を持つピクセルのアレイを含むデバイスです。SLM には、マイクロエレクトロメカニカルミラーまたは液晶コンポーネントが含まれています。画像は通常、電荷結合素子(CCD) カメラによって取得されます。

これらの共焦点顕微鏡の各クラスには、特定の長所と短所があります。ほとんどのシステムは、記録速度（ビデオキャプチャなど）または高空間解像度のいずれかに最適化されています。共焦点レーザー走査顕微鏡は、プログラム可能なサンプリング密度と非常に高い解像度を持つことができますが、ニプコウとPAMは、カメラの解像度によって定義される固定サンプリング密度を使用します。シングルポイントレーザー走査システムのイメージングフレームレートは、通常、回転ディスクまたはPAMシステムよりも遅くなります。市販の回転ディスク共焦点顕微鏡は、1秒あたり50を超えるフレームレートを実現します^[6]。これは、生細胞イメージングなどの動的観察に望ましい機能です。

実際には、ニプコウ法とPAM法では、ピンホールが十分に離れている限り、 複数のピンホールが同じ領域を並行してスキャンすることを可能にします^{[7] 。}

共焦点レーザー走査顕微鏡の最先端の開発により、複数のマイクロエレクトロメカニカル走査ミラーを使用することで、標準のビデオレート (毎秒 60 フレーム) よりも優れたイメージングが可能になりました。

共焦点X線蛍光イメージングは​​、例えば絵画に埋もれた層を分析する場合に、水平方向と垂直方向の照準に加えて深さの制御を可能にする新しい技術である。^[8]

CLSM は走査型イメージング技術であり、その解像度は走査型電子顕微鏡(SEM)などの別の走査技術と比較すると最もよく説明されます。CLSM の利点は、たとえばAFMやSTM のように、プローブを表面から数ナノメートル離して吊るす必要がないことです。AFM や STMでは、表面上で細い先端を走査することで画像を取得します。対物レンズから表面までの距離 (作動距離と呼ばれる) は、通常、従来の光学顕微鏡と同程度です。システムの光学設計によって異なりますが、作動距離は数百マイクロメートルから数ミリメートルが一般的です。

CLSM では、試料は点レーザー光源によって照射され、各体積要素は離散的な散乱または蛍光強度に関連付けられます。ここで、走査体積のサイズは光学系のスポットサイズ (回折限界に近い) によって決まります。これは、走査レーザーの像が無限に小さい点ではなく、3 次元の回折パターンであるためです。この回折パターンのサイズとそれが定義する焦点体積は、システムの対物レンズの開口数と使用するレーザーの波長によって制御されます。これは、広視野照明を使用する従来の光学顕微鏡の古典的な解像度の限界と見ることができます。ただし、共焦点顕微鏡では、共焦点開口部を絞って回折パターンの高次を排除できるため、広視野照明技術の解像度の限界をさらに改善することもできます^[要出典]。たとえば、ピンホールの直径を 1エアリー単位に設定すると、回折パターンの 1 次だけが開口部を通過して検出器に到達し、高次がブロックされるため、明るさがわずかに低下する代わりに解像度が向上します。蛍光観察では、共焦点顕微鏡の解像度の限界は、蛍光顕微鏡で通常利用できる光子の数が少ないために生じる信号対雑音比によって制限されることが多い。この影響は、より感度の高い光検出器を使用するか、照明レーザー点光源の強度を上げることで補正できる。照明レーザーの強度を上げると、蛍光輝度の比較が必要な実験では特に、対象標本が過度に退色したり、その他の損傷を受けたりするリスクがある。植物の葉の海綿状の葉肉やその他の空気空間を含む組織など、屈折率が異なる組織を画像化する場合、共焦点画像の品質を損なう球面収差が顕著になることが多い。しかし、組織に容易に浸透し、屈折率が水とほぼ同じであるパー​​フルオロデカリンなどの光学的に透明で毒性のないパーフルオロカーボンにサンプルをマウントすることで、このような収差を大幅に低減できる。^[9]反射ジオメトリでイメージングすると、細胞内小器官のような物体の反射光と散乱光の干渉を検出することもできます。信号の干渉特性により、ピンホール径を0.2エアリー単位まで縮小できるため、共焦点蛍光顕微鏡のように信号対雑音比を犠牲にすることなく、理想的な√2の解像度向上が可能になります。^[10]

CLSMは、細胞生物学や遺伝学から微生物学や発生生物学に至るまで、さまざまな生物科学分野で広く使用されています。^[11]また、量子光学やナノ結晶イメージングや分光法でも使用されています。

臨床的には、CLSMはさまざまな眼疾患の評価に使用されており、特に角膜内皮細胞の画像化、定性分析、定量化に有用である。 [ ^12]角膜真菌症の場合、角膜実質内の糸状真菌要素の存在を特定して特定するために使用され、迅速な診断と早期の根治的治療の開始を可能にする。内視鏡手術（内視鏡下顕微鏡検査）のためのCLSM技術の研究も有望である。^[13]製薬業界では、薬物分布の品質と均一性を管理するために、薄膜医薬品の製造プロセスを追跡することが推奨されている。^[14]共焦点顕微鏡は、微生物の好ましい生息地である複雑な多孔質構造であるバイオフィルムの研究にも使用されている。バイオフィルムの時間的および空間的機能の一部は、マイクロスケールとメソスケールでの構造を研究することによってのみ理解できる。マイクロスケールの研究は、単一の微生物の活動と組織を検出するために必要である。^[15]

CLSM は、一部の3D 光学データ ストレージシステムのデータ取得メカニズムとして使用されており、マグダレン パピルスの年代を特定するのに役立っています。

IRENEシステムは共焦点顕微鏡を利用して光学スキャンを行い、損傷した歴史的オーディオを復元します。^[16]

レーザー走査型共焦点顕微鏡は、太陽電池製造に使用されるシリコンウェーハなどの微細構造材料の表面特性評価に使用されます。最初の処理ステップでは、ウェーハを酸またはアルカリ化合物で湿式化学エッチングし、表面にテクスチャを作成します。次に、レーザー共焦点顕微鏡を使用して、マイクロメータ レバーで得られた表面の状態を観察します。レーザー共焦点顕微鏡は、太陽電池の上部に印刷された金属化フィンガーの厚さと高さの分析にも使用できます。

ピンホールの点像分布関数は楕円体で、長さは幅の数倍になります。これにより、顕微鏡の軸方向の解像度が制限されます。これを克服する 1 つの技術が4Pi 顕微鏡法です。この顕微鏡法では、入射光と放射光がサンプルの上下から干渉して楕円体の体積を減らします。別の技術として、共焦点シータ顕微鏡法があります。この技術では、照明光の円錐と検出光は互いに角度をなしています (垂直の場合に最良の結果が得られます)。2 つの点像分布関数の交差により、有効サンプル体積が大幅に小さくなります。ここから、単面照明顕微鏡が生まれました。さらに、実験的に導出された点像分布関数を使用してデコンボリューションを採用し、焦点外の光を除去して、軸方向と横方向の両方の平面のコントラストを改善することもできます。

誘導放出抑制顕微鏡法(STED)など、回折限界以下の解像度を実現する共焦点のバリエーションがあります。この技術の他にも、 PALM、(d)STORM 、SIM など、さまざまな (共焦点ベースではない)超解像技術が利用できます。これらはすべて、使いやすさ、解像度、特別な装置、バッファー、蛍光体の必要性など、独自の利点があります。

低温でサンプルを画像化するために、2つの主なアプローチが使用されてきましたが、どちらもレーザー走査型共焦点顕微鏡アーキテクチャに基づいています。 1つのアプローチは、連続フロークライオスタットを使用することです。サンプルのみが低温にあり、透明な窓を通して光学的にアドレス指定されます。^{[17]もう1つの可能なアプローチは、光学系の一部（特に顕微鏡の対物レンズ）を}極低温保存デュワーに入れることです。^[18]この2番目のアプローチは、より面倒ですが、より優れた機械的安定性を保証し、ウィンドウによる損失を回避します。

CLSM を使用して分子相互作用を研究するには、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET) を使用して、2 つのタンパク質が互いに一定の距離内にあることを確認できます。

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  テトラヒメナ（繊毛原生動物）のβ-チューブリン。
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  ニプコーディスク共焦点顕微鏡で測定した 1 ユーロ硬貨の部分的な表面プロファイル。
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  1ユーロ硬貨の反射データ。
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  癌細胞内のアクチンフィラメントの色分けされた画像。
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  4 日齢のArabidopsis thaliana根端分裂組織細胞 (Col-0) の緑色のシグナル (Alexa Fluor 488 で結合した抗チューブリン抗体からの緑色のシグナル) と核 (DAPI で染色した DNA からの青色のシグナル)。スケール バー: 5 um。

1940年、スイスのベルンの眼科医ハンス・ゴールドマンは、眼科検査を記録するためのスリットランプシステムを開発しました。 ^[19]このシステムは、後の研究者によって最初の共焦点光学システムであると考えられています。^{[20] [21]}

1943年にZyun Koanaは共焦点システムを発表しました。^{[22] [20]}

1951年、小穴の同僚である直良弘人は、分光測光法に関する共焦点顕微鏡について科学誌「サイエンス」に発表した。^[23]

最初の共焦点走査顕微鏡は1955年にマービン・ミンスキーによって製作され、1957年に特許が申請された。焦点面の照明点の走査はステージを動かすことで実現された。科学論文は提出されず、この顕微鏡で撮影された画像は保存されていない。^{[2] [24]}

1960年代、チェコスロバキアのプルゼニ・カレル大学医学部のモイミール・ペトランは、最初の商用共焦点顕微鏡であるタンデム走査顕微鏡を開発しました。これはチェコスロバキアの小さな会社によって販売され、米国ではトラコール・ノーザン（後のノーラン）によって販売され、回転するニプコーディスクを使用して複数の励起ピンホールと放出ピンホールを生成しました。^{[21] [25]}

チェコスロバキアの特許は、1966年にペトラニとチェコスロバキアの同僚ミラン・ハドラフスキーによって申請された。この顕微鏡で生成されたデータと画像を含む最初の科学論文は、1967年に科学誌サイエンスに掲載され、エール大学のM.デイヴィッド・エッガーとペトラニが執筆した。^[26]この論文の脚注には、ペトラニが顕微鏡を設計し、その構築を監督したこと、そして彼がエール大学の「研究員」であったことが記されている。1968年の2番目の論文では、この装置の理論と技術的詳細が説明され、ハドラフスキーとエール大学のグループ長ロバート・ガランボスが追加の著者として参加した。 ^[27] 1970年に米国特許が付与された。これは1967年に申請された。^[28]

1969年と1971年に、イェール大学のM. David EggerとPaul Davidovitsが、世界初の共焦点レーザー走査顕微鏡に関する2つの論文を発表しました。^{[29] [30]}これはポイントスキャナーで、生成される照明スポットは1つだけでした。神経組織の観察には落射照明反射顕微鏡を使用しました。633 nmの光を持つ5mWヘリウムネオンレーザーが、半透明の鏡によって対物レンズに向かって反射されました。対物レンズは、焦点距離8.5mmの単純なレンズでした。以前のすべてのシステムと後のほとんどのシステムとは対照的に、サンプルはこのレンズの動きによってスキャンされ（対物レンズスキャン）、焦点が移動しました。反射光は半透明の鏡に戻り、透過部分は別のレンズによって検出ピンホールに焦点を合わせられ、その後ろに光電子増倍管が配置されました。信号はオシロスコープのCRTによって視覚化され、陰極線は対物レンズと同時に移動しました。特別な装置によってポラロイド写真が作られ、そのうちの 3 枚が 1971 年の出版物に掲載されました。

著者らは、生体内調査のための蛍光染料について推測している。彼らはミンスキーの特許を引用し、当時ニューヨーク市のアルバート・アインシュタイン医科大学の博士課程の学生で共焦点線走査顕微鏡を開発したスティーブ・ベアに感謝し、^[31]「ミンスキーの顕微鏡」でレーザーを使用することを提案したガランボス、ハドラフスキー、ペトランに感謝している。彼らが顕微鏡を開発するきっかけとなったのは、タンデム走査顕微鏡では、照明光のわずか10-7分の1しか接眼レンズで画像を生成するのに関与していないことだった^。そのため、ほとんどの生物学的調査では画像品質が不十分だった。^{[20] [32]}

1977年、英国オックスフォード大学のコリン・J・R・シェパードとアマルジョティ・チョードリーは、共焦点顕微鏡とレーザー走査顕微鏡の理論的分析を発表しました。^[33]これはおそらく「共焦点顕微鏡」という用語を使用した最初の出版物です。^{[20] [32]}

1978年、クリストフ・クレマーとトーマス・クレマーの兄弟は、電子オートフォーカスを備えた蛍光励起を使用した共焦点レーザー走査顕微鏡の設計を発表しました。彼らはまた、「4πポイントホログラム」を使用したレーザーポイント照明を提案しました。^{[32] [34]このCLSM設計は、レーザースキャン法と}蛍光マーカーで標識された生物学的物体の3D検出を初めて組み合わせたものでした。

1978年と1980年に、コリン・シェパードとトニー・ウィルソンを中心としたオックスフォードグループは、エピレーザー照明、ステージスキャン、光電子増倍管を検出器として備えた共焦点顕微鏡を開発した。ステージは光軸（Z軸）に沿って移動でき、光学的な連続切片を作製することができた。^[32]

1979年、フレッド・ブレーケンホフと同僚は、光学セクショニングと解像度向上の理論的な利点が実際に達成可能であることを実証しました。1985年、このグループは、生物学的な疑問に答えることができる説得力のある共焦点顕微鏡で撮影した画像を初めて発表しました。^[35]その後すぐに、多くのグループが共焦点顕微鏡を使用して、それまで技術的な制限のために謎のままであった科学的疑問に答え始めました。

1983年、オックスフォード大学のIJコックスとC.シェパードは、共焦点顕微鏡をコンピュータで制御する最初の研究を発表しました。最初の商用レーザー走査顕微鏡であるステージスキャナSOM-25は、オックスフォードオプトエレクトロニクス（バイオラッドによる数回の買収後）によって1982年から提供されました。これはオックスフォードグループの設計に基づいていました。^{[21] [36]}

1980年代半ば、ウィリアム・ブラッドショー・エイモスとジョン・グラハム・ホワイト、そしてケンブリッジの分子生物学研究所の同僚らは、最初の共焦点ビーム走査型顕微鏡を製作した。^{[37] [38]}サンプルを載せたステージは動かず、代わりに照明スポットが動くため、より高速な画像取得が可能となり、1秒間に512ラインの画像4枚を撮影できた。1～2メートルのビーム経路により中間画像が非常に拡大されたため、直径約1mmの従来の絞り絞りを「ピンホール」として使用できた。最初の顕微鏡写真は、デジタルカメラが追加される前に、フィルムに長時間露光して撮影された。さらに改良を加えた結果、初めて標本にズームインすることが可能になった。ツァイス、ライツ、ケンブリッジ・インストゥルメンツは、商業生産には興味がなかった。^[39]最終的に、英国医学研究会議（MRC）がプロトタイプの開発を後援した。後継機MRC 600は、後にコーネル大学で1990年に開発された最初の2光子蛍光顕微鏡の開発の基礎となった。^[35]

同じ頃、ストックホルムの王立工科大学（KTH）での開発により、スウェーデンの企業サラストロ社がCLSMを販売するようになりました。 ^[40]このベンチャー企業は1990年にモレキュラー・ダイナミクス社に買収されましたが、^[41] CLSMは最終的に製造中止となりました。ドイツでは、1984年に設立されたハイデルベルグ・インストゥルメンツ社がCLSMを開発しました。これは当初、生物学ではなく産業用途を対象としていました。この機器は1990年にライカ・レーザーテクニック社に買収されました。ツァイス社はすでに非共焦点フライングスポットレーザー走査顕微鏡を市場に出しており、共焦点にアップグレードされました。1990年のレポート^[42]には、共焦点の製造業者としてサラストロ社、テクニカル・インストゥルメンツ社、メリディアン・インストゥルメンツ社、バイオ・ラッド社、ライカ社、トラコール・ノーザン社、ツァイス社が挙げられています。^[35]

1989年、フリッツ・カール・プレイクシャットは息子のエックハルト・プレイクシャットとともに、粒子サイズ分析用の走査型レーザーダイオード顕微鏡を発明しました。 ^{[43] [44]}そして、それを商品化するためにLasentecを共同設立しました。2001年、Lasentecはメトラー・トレドに買収されました。^[45]これらは主に製薬業界で、大規模な精製システムにおける結晶化プロセスのin-situ制御を提供するために使用されています。

標準的な共焦点装置では、2 番目のピンホール、つまり「出力」ピンホールは、放出された光や散乱した光をフィルタリングするために使用されます。従来、このピンホールは光を遮断して照明を光学的にフィルタリングする受動コンポーネントです。ただし、新しい設計では、このフィルタリングをデジタルで実行しようとしています。

最近のアプローチでは、受動的なピンホールを複合検出器要素に置き換えています。通常、このアプローチではデジタル処理後に解像度の限界が無限に小さいピンホールに近づくため、解像度と光子予算が向上します。^[46]

他の研究者は、深層畳み込みニューラルネットワークを使用して、点励起光源からの光をデジタル的に再焦点化することを試みた。^[47]

• 2 光子励起顕微鏡: 関連する技術 (両方ともレーザー走査顕微鏡) を使用していますが、多光子蛍光顕微鏡は厳密には共焦点顕微鏡ではありません。共焦点という用語は、共役焦点面(共焦点)に絞りが存在することに由来しています。この絞りは、ビームのデスキャンが困難なため、多光子顕微鏡では通常存在しません。

• Hoffman, David P.; Shtengel, Gleb; Xu, C. Shan; Campbell, Kirby R.; Freeman, Melanie; Wang, Lei; Milkie, Daniel E.; Pasolli, H. Amalia; Iyer, Nirmala; Bogovic, John A.; Stabley, Daniel R.; Shirinifard, Abbas; Pang, Song; Peale, David; Schaefer, Kathy; Pomp, Wim; Chang, Chi-Lun; Lippincott-Schwartz, Jennifer; Kirchhausen, Tom; Solecki, David J.; Betzig, Eric; Hess, Harald F. (2020). 「硝子体凍結細胞全体の相関3次元超解像およびブロックフェイス電子顕微鏡法」。Science。367 ( 6475 ): eaaz5357。doi :10.1126/science.aaz5357. ISSN  0036-8075. PMC 7339343. PMID  31949053 . 

ウィキメディア・コモンズには共焦点顕微鏡に関連するメディアがあります。

• 仮想CLSM（Javaベース）
• 蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡など、さまざまなタイプの顕微鏡に関するアニメーションと説明（パリ南大学）
• 部品は知っておく必要があります。