懸濁培養

細胞懸濁液または懸濁培養は、単一細胞または小さな細胞集合体が撹拌された増殖培地中で機能および増殖し、懸濁液を形成するタイプの細胞培養である。懸濁培養は、接着培養と並んで古典的な2種類の細胞培養の1つである。懸濁細胞培養の歴史は、細胞培養全体の歴史と密接に関連しているが、維持方法や商業的応用が異なっている。細胞自体は、均質化された組織または不均一な細胞溶液に由来することができる。懸濁細胞培養は、造血細胞、植物細胞、昆虫細胞などの非接着細胞株の培養によく使用される。^[1]一部の細胞株は懸濁液中で培養されるが、市販されている哺乳類細胞株の大部分は接着性である。^{[2] [3]}懸濁細胞培養では、細胞を懸濁状態に保つために撹拌する必要があり、特殊な装置（磁気撹拌プレート、オービタルシェーカー、インキュベーターなど）とフラスコ（培養フラスコ、スピナーフラスコ、シェーカーフラスコなど）が必要になる場合があります。^[4]これらの培養は、細胞死を避けるために、栄養素を含む培地で維持し、特定の細胞密度範囲で培養する必要があります。^[5]

懸濁細胞培養の歴史は、細胞および組織培養の全体的な歴史と密接に結びついています。1885年、ウィルヘルム・ルーは、生きた細胞（ニワトリの胚）を数日間維持するために使用する生理食塩水緩衝液を開発し、将来の組織培養の基礎を築きました。^[6] その後、ロス・グランビル・ハリソンは1907年に、神経細胞用のハンギングドロップ法の改良や培養プロセスへの無菌法の導入など、in vitro細胞培養技術を開発しました。 ^[7]その後、1910年に、モントローズ・トーマス・バロウズはハリソンの技術を採用し、アレクシス・カレルと協力して、新鮮な血漿と生理食塩水を組み合わせてin vitroで維持できる複数の組織培養を確立しました。[ 8 ^]カレルは、ニワトリの胚の心臓から得られた最初の細胞株を開発し、34年間継続的に維持されました。^{[9]細胞株の「不死性」は後に}レナード・ヘイフリックによって疑問視されましたが、これは大きな進歩であり、他の人々が他の細胞株の作成を追求するきっかけとなりました。^[10] 1952年にジョージ・オットー・ゲイと助手のメアリー・クビチェクは、最初のヒト由来の不死化細胞株であるHeLaを培養しました。他の細胞株が接着性であったのに対し、HeLa細胞は浮遊状態で維持することができました。^[11]

すべての初代培養細胞（被験者から直接採取した細胞）は、まず被験者から採取し、分離し（消化酵素を使用）、培養前に培地に懸濁する必要があります。^[1]しかし、これはこれらの細胞が懸濁培養に適合していることを意味するものではありません。ほとんどの哺乳類細胞は接着性であり、分裂するためには表面に付着する必要があるためです。白血球は血液中に自然に懸濁して存在するため、被験者から採取し、懸濁培養することができます。^[12]生体内での白血球の接着は、通常、炎症性免疫反応の結果であり、単一タイプの白血球の懸濁液では発生しないはずの特定の細胞間相互作用が必要です。^[13]

不死化哺乳類細胞株（無期限に複製できる細胞）、植物細胞、昆虫細胞は、メーカーから凍結保存された状態で入手でき、懸濁培養を開始するために使用できます。^[14]凍結保存された細胞から培養を開始するには、まず細胞を解凍し、培地の入ったフラスコまたはバイオリアクターに追加する必要があります。凍結保護剤によっては、薬剤の有害な影響を避けるために細胞を洗浄する必要がある場合があります。^[3]

浮遊細胞培養は、接着培養と多くの点で類似しています。どちらも、特殊な栄養素を含む培地、ガス移動を可能にする容器、汚染を避けるための無菌状態、細胞の過密を防ぐための頻繁な継代を必要とします。しかし、これらの類似点の中にも、これらの培養方法にはいくつかの重要な違いがあります。たとえば、接着細胞培養と浮遊細胞培養はどちらも T-75 組織培養フラスコなどの標準的なフラスコで維持できますが、浮遊培養はフラスコの底に沈殿するのを防ぐために撹拌する必要があります。接着細胞培養は、細胞接着を促進するために表面積の大きい平らなフラスコで維持できますが、浮遊培養では撹拌が必要です。撹拌しないと細胞がフラスコの底に落ち、栄養素と酸素へのアクセスに大きな影響を与え、最終的に細胞死につながります。^[4]このため、培地を撹拌し細胞を懸濁状態に保つための特殊なフラスコ（以下で説明するスピナーフラスコやシェーカーフラスコを含む）が開発されてきた。しかし、培地を撹拌すると細胞にせん断力が加わり、細胞にストレスがかかり成長に悪影響を与える可能性がある。接着細胞培養と懸濁細胞培養の両方に培地が必要であるが、懸濁培養で使用される培地には、DMEMなどの培養培地に含まれるアミノ酸、ビタミン、塩溶液に加えて、せん断力から細胞を保護するための界面活性剤が含まれている場合がある。^[5]

懸濁培養に使用されるスピナーフラスコには、フラスコ内で培地を循環させ、細胞を懸濁状態に保つ磁気スピナーバーが含まれています。^[15]スピナーフラスコには、中央にキャップ付きの開口部が 1 つあり、その両側に 2 つの突出アームがあり、これらもキャップ付きで、追加のガス交換を可能にします。磁気スピナーバー自体は、通常、中央のキャップに取り付けられたロッドから吊り下げられており、細胞懸濁液内での培地の循環を最大化します。細胞を培養する場合、細胞が入ったスピナーフラスコをインキュベーター内の磁気撹拌プレート上に置き、せん断力で細胞を殺さないようにスピナーパラメータを慎重に調整する必要があります。^[16]

シェーカーフラスコも懸濁培養に使用され、典型的なエルレンマイヤーフラスコに似ていますが、ガス交換を可能にするために半透過性の蓋が付いています。^[17]懸濁細胞培養中、シェーカーフラスコに細胞と適切な培地を入れてから、オービタルシェーカーに置きます。細胞培養の増殖を最適化するには、使用する細胞と培地に応じて、オービタルシェーカーの回転数を許容範囲内で調整する必要があります。培地は攪拌する必要がありますが、細胞をあまりかき混ぜて過度のストレスを与えてはなりません。シェーカーフラスコは、酵母などの微生物の発酵培養によく使用されます。^[18]

浮遊細胞培養の継代、つまりサブカルチャーは、接着細胞の継代より簡単です。接着細胞は、培養フラスコの表面からそれらを除去するために、消化酵素での初期処理が必要ですが、浮遊細胞は培地に自由に浮遊しています。^[19]次に、培養物からサンプルを採取して分析し、生細胞と死細胞の比率（トリパンブルーなどの染色を使用）とフラスコ内の細胞の総濃度（血球計を使用）を決定できます。この情報を使用して、現在の浮遊培養の一部を新しいフラスコに移し、培地を補充します。継代回数を記録しておく必要があります。特に、細胞が初代細胞株は最終的に老化するため、不死化されていない場合はそうです。^[20]浮遊細胞は、培地を変更せずにそのまま継代されることがよくあります。浮遊培養の培地を変更するには、現在の容器からすべての細胞を取り出し、遠心分離してペレットにする必要があります。次に、遠心分離したサンプルから余分な培地を取り除き、フラスコに新鮮な培地を補充してから、細胞を再びフラスコに加えます。細胞は増殖するために培地内の栄養素を消費するため、培地の交換と継代培養は細胞株を維持するために重要です。また、栄養不足、極端な pH、または増殖スペースの不足により環境が不適切になるまで、細胞は指数関数的に増殖します。

増殖できる表面積に制限される 接着培養とは異なり、懸濁培養は容器の容積によって制限されます。つまり、懸濁細胞は特定のフラスコ内にはるかに大量に存在することができ、タンパク質、抗体、代謝産物などの製品を作るために細胞を使用する場合、または単に大量の細胞を生成する場合に好まれます。ただし、哺乳類の懸濁細胞株は、哺乳類の接着細胞株よりもはるかに少ないです。大規模な懸濁培養のほとんどは、非哺乳類細胞を伴い、バイオリアクターで行われます。

懸濁細胞培養の例:

• ハイブリドーマによる抗体産生^[21]
• ビールの発酵培養物^[22]
• CHO細胞による治療用タンパク質の生産^[23]
• 植物細胞における薬物の二次代謝産物の生産^[24]
• 昆虫細胞における組み換えタンパク質の生産^[25]
• 酵素およびワクチン研究のための大量タンパク質生産^[26]
• 癌免疫療法に使用される腫瘍溶解性アデノウイルスをサポートする細胞懸濁培養の生産^[27]

• 細胞培養
• 忠実な文化
• バイオMEMS
• 細胞接着
  • 細胞接着分子