トランスクリプトミクス技術は 、生物のトランスクリプトーム 、つまりその生物のすべてのRNA転写産物 の総体を研究するために用いられる技術です。生物の情報内容は、ゲノム のDNAに記録され、転写 によって発現されます 。ここで、mRNAは 情報ネットワークにおける一時的な中間分子として機能し、非コードRNAはその他の多様な機能を果たします。トランスクリプトームは、 細胞 内に存在する全転写産物の特定の時点におけるスナップショットを捉えたものです。トランスクリプトミクス技術は、どの細胞プロセスが活性化しており、どのプロセスが休止状態にあるかを包括的に説明します。分子生物学における大きな課題の一つは、単一 のゲノムからどのように多様な細胞が生じるのかを理解することです。もう一つの課題は、遺伝子発現がどのように制御されているかを理解することです。
全トランスクリプトームの研究は1990年代初頭に初めて試みられました。1990年代後半以降の技術進歩により、この分野は繰り返し変革され、トランスクリプトミクスは生物科学 における広く普及した学問分野となりました。この分野には、あらかじめ決められた配列のセットを定量化するマイクロアレイと、 ハイスループットシーケンス を用いてすべての転写産物を記録するRNA-Seq という2つの主要な現代的技術があります。技術の進歩に伴い、各トランスクリプトーム実験で生成されるデータ量は増加しました。その結果、データ解析手法は、ますます増大するデータ量をより正確かつ効率的に解析するために着実に改良されてきました。トランスクリプトームが研究者によって収集・共有され続けるにつれて、トランスクリプトームデータベースはますます大規模化し、有用性も高まっています。過去の実験に関する知識がなければ、トランスクリプトームに含まれる情報を解釈することはほぼ不可能でしょう。
生物の遺伝子 発現を様々な組織 や条件下 、あるいは異なる時期に測定することで、遺伝子がどのように制御され ているかに関する情報が得られ、生物の生物学的特性の詳細が明らかになります。また、これまで注釈が付けられていなかった 遺伝子の機能を推測するためにも利用できます。トランスクリプトーム解析は、様々な生物における遺伝子発現の変化に関するより深い洞察を可能にし、ヒト 疾患 の理解に大きく貢献してきました。遺伝子発現全体を解析することで、より標的を絞ったアッセイ では検出できない、広範囲にわたる協調的な傾向を検出することができます。
歴史 トランスクリプトミクス手法の使用状況の推移。 1990年以降に発表された、RNA-Seq(黒)、RNAマイクロアレイ(赤)、発現配列タグ(青)、デジタル差分表示 (緑)、および遺伝子発現のシリアル/キャップ解析(黄)に関する論文。[ 1 ] トランスクリプトミクスは、10年ごとに可能性を再定義し、以前の技術を時代遅れにする新しい技術の開発によって特徴付けられてきました。部分的なヒトトランスクリプトームをキャプチャする最初の試みは1991年に発表され、ヒト脳 から609個のmRNA 配列が報告されました。[ 2 ] 2008年には、16,000個の遺伝子をカバーする数百万個の転写産物由来配列で構成される2つのヒトトランスクリプトームが発表され、[ 3 ] [ 4 ] 2015年までに数百人の個人のトランスクリプトームが発表されました。[ 5 ] [ 6 ] さまざまな疾患 状態、組織 、または単一細胞 のトランスクリプトームが現在では日常的に生成されています。[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] このトランスクリプトミクスの爆発的な発展は、感度と経済性が向上した新しい技術の急速な開発によって推進されてきました。[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]
データ収集 RNA転写産物に関するデータを生成するには、主に2つの方法があります。個々の転写産物のシーケンス(EST 、またはRNA-Seq)または転写産物をヌクレオチドプローブの配列(マイクロアレイ)にハイブリダイゼーションさせる方法です。 [ 23 ]
発現配列タグ (EST)は、単一のRNA転写産物から生成される短いヌクレオチド配列です。RNAはまず逆転写酵素によって 相補的DNA (cDNA)として複製され、その後、得られたcDNAが配列決定されます。[ 16 ] ESTは、由来する生物に関する事前の知識がなくても収集できるため、生物の混合物や環境サンプルから作成できます。[ 49 ] [ 16 ] 現在ではハイスループット法が使用されていますが、ESTライブラリは 初期のマイクロアレイ設計に配列情報を提供するのに一般的に使用されていました。たとえば、オオムギの マイクロアレイは、以前に配列決定された35万個のESTから設計されました。[ 50 ]
マイクロアレイ DNAマイクロアレイ の概要。 生物体内では、遺伝子が転写され、スプライシング(真核生物の場合)されて成熟したmRNA転写産物(赤)が生成されます。mRNAは生物から抽出され、逆転写酵素を用いてmRNAを安定なds-cDNA(青)にコピーします。マイクロアレイでは、ds-cDNAは断片化され、蛍光標識されます(オレンジ)。標識された断片は、相補的なオリゴヌクレオチドの整列したアレイに結合し、アレイ全体の蛍光強度を測定する ことで、あらかじめ定められた一連の配列の存在量を示します。これらの配列は通常、生物のゲノム内の目的の遺伝子を報告するために特別に選択されます。[ 51 ]
RNAシーケンス RNA-Seq の概要。 生物体内では、遺伝子が転写され、(真核生物では)スプライシングされて成熟した mRNA 転写産物(赤)が生成されます。mRNA は生物から抽出され、断片化されて、安定した ds-cDNA(青)にコピーされます。ds-cDNA は、ハイスループットの ショートリードシーケンス法を使用してシーケンスされます。これらの配列は、参照ゲノム配列にアラインメントし て、どのゲノム領域が転写されていたかを再構築できます。このデータは、発現遺伝子の位置、相対的な発現レベル、および代替スプライシングバリアントを注釈するために使用できます。[ 51 ]
原理と進歩 RNA-Seq は、 ハイスループット シーケンス 法と計算手法を組み合わせて、RNA 抽出物中に存在する転写産物を捕捉および定量化する手法を指します。[ 10 ] 生成されるヌクレオチド配列は通常 100 bp 程度の長さですが、使用するシーケンス法によっては 30 bp から 10,000 bp を超える範囲になることがあります。RNA-Seq は、トランスクリプトームから多数の短い断片を深くサンプリング することで、参照ゲノムまたは互いにリードをアラインメントする ことによって元の RNA 転写産物を計算によって再構築することを可能にします( de novo アセンブリ )。[ 9 ] RNA-Seq 実験では、低存在量および高存在量の RNA の両方を定量化できます (ダイナミック レンジ は 5桁 ) - これは、マイクロアレイ トランスクリプトームに対する重要な利点です。さらに、RNA-Seq の入力 RNA 量はマイクロアレイ (マイクログラム量) に比べてはるかに少なく (ナノグラム量)、cDNA の増幅と組み合わせることで、単一細胞解像度でもトランスクリプトームを調べることができます。[ 25 ] [ 60 ] 理論的には、RNA-Seq には定量の上限はなく、非反復領域の 100 bp リードのバックグラウンド ノイズは非常に低くなっています。[ 10 ]
RNA-Seq は、ゲノム 内の遺伝子を特定したり、特定の時点でどの遺伝子が活性化しているかを特定したりするために使用でき、リード カウントを使用して相対的な遺伝子発現レベルを正確にモデル化できます。RNA-Seq 手法は、主にスループット、精度、およびリード長を増加させる DNA シーケンス技術の開発を通じて、絶えず改善されてきました。[ 61 ] 2006 年と 2008 年に初めて記述されて以来、[ 40 ] [ 62 ] RNA-Seq は急速に採用され、2015 年にトランスクリプトミクスの主要な技術としてマイクロアレイを追い越しました。[ 63 ]
個々の細胞レベルでのトランスクリプトームデータの探求は、RNA-Seqライブラリー調製法の進歩を促し、感度の劇的な向上をもたらしました。現在では、単一細胞のトランスクリプトームは 十分に解明されており、固定 組織内で個々の細胞のトランスクリプトームを直接解析するin situ RNA-Seqにまで拡張されています。[ 64 ]
方法 RNA-Seqは、さまざまなハイスループットDNAシーケンス技術の急速な発展と並行して確立されました。[ 65 ] しかし、抽出されたRNA転写産物をシーケンスする前に、いくつかの重要な処理ステップが実行されます。転写産物の濃縮、断片化、増幅、シングルエンドまたはペアエンドシーケンスの使用、および鎖情報を保持するかどうかによって方法が異なります。[ 65 ]
RNA-Seq 実験の感度は、関心のある RNA クラスを濃縮し、既知の豊富な RNA を除去することによって高めることができます。mRNA 分子は、ポリ A テール に結合するオリゴヌクレオチド プローブを使用して分離できます。あるいは、リボ除去を使用して、分類群の 特定の rRNA 配列 (哺乳類 rRNA、植物 rRNA など)に合わせたプローブとのハイブリダイゼーションにより、豊富だが情報のないリボソーム RNA (rRNA) を特異的に除去することもできます。ただし、リボ除去は、非特異的なオフターゲット転写産物の除去によってバイアスを導入する可能性もあります。[ 66 ] マイクロ RNA などの小さな RNA は、ゲル電気泳動 と抽出によってサイズに基づいて精製できます。
mRNAは一般的なハイスループットシーケンス法の読み取り長よりも長いため、転写産物は通常、シーケンスの前に断片化されます。[ 67 ] 断片化方法は、シーケンスライブラリ構築の重要な側面です。断片化は、 化学的加水分解 、ネブライザー処理 、超音波処理 、または鎖終結ヌクレオチド を用いた逆転写 によって達成できます。[ 67 ] あるいは、トランスポザーゼ酵素 を使用することで、断片化とcDNAタグ付けを同時に行うこともできます。[ 68 ]
シーケンスの準備中に、転写産物の cDNA コピーは、予想される 5' および 3' アダプター配列を含む断片を濃縮するためにPCRによって増幅されることがあります。 [ 69 ] 増幅は、極端なアプリケーションでは 50 pg という非常に少ない入力量の RNA のシーケンスを可能にするためにも使用されます。[ 70 ] 既知の RNA のスパイクイン コントロールは、 GC 含有量 、断片長、および転写産物内の断片の位置によるバイアスの観点から、ライブラリーの準備とシーケンスをチェックするための品質管理評価に使用できます。 [ 71 ] ユニーク分子識別子 (UMI) は、ライブラリーの準備中に配列断片を個別にタグ付けするために使用される短いランダム配列であり、タグ付けされたすべての断片がユニークになります。[ 72 ] UMI は、定量化のための絶対スケール 、ライブラリー構築中に導入された後続の増幅バイアスを補正する機会、および初期サンプルサイズを正確に推定する機会を提供します。 UMIは、入力RNAの量が制限され、サンプルの増幅を長くする必要があるシングルセルRNA-Seqトランスクリプトミクスに特に適しています。[ 73 ] [ 74 ] [ 75 ]
転写産物分子が準備されると、一方向(シングルエンド)または両方向(ペアエンド)に配列決定できます。シングルエンド配列は通常、ペアエンド配列よりも作成が速く、安価で、遺伝子発現レベルの定量化に十分です。ペアエンド配列は、より堅牢なアライメント/アセンブリを生成するため、遺伝子アノテーションと転写産物アイソフォームの 発見に有益です。[ 10 ] ストランド特異的RNA-Seq法は、配列決定された転写産物のストランド 情報を保持します。[ 76 ] ストランド情報がない場合、リードは遺伝子座 にアライメントできますが、遺伝子がどちらの方向に転写されているかはわかりません。ストランド特異的RNA-Seqは、異なる方向に重複する遺伝子 の転写を解読し、非モデル生物でより堅牢な遺伝子予測を行うのに役立ちます。[ 76 ]
凡例:NCBI SRA – 国立バイオテクノロジー情報センターのシーケンスリードアーカイブ。
現在、RNA-Seq は、シーケンスの前に RNA 分子を cDNA 分子にコピーすることに依存しています。そのため、トランスクリプトーム データとゲノム データの後続のプラットフォームは同じです。したがって、DNA シーケンス技術の開発は RNA-Seq の特徴となっています。[ 78 ] [ 80 ] [ 81 ] ナノポア シーケンス を使用した RNA の直接シーケンスは、現在の最先端の RNA-Seq 技術です。[ 82 ] [ 83 ] RNA のナノポア シーケンスは、cDNA のシーケンス時にマスクされる修飾塩基 を検出でき、バイアスを導入する可能性のある増幅 ステップも排除します。[ 11 ] [ 84 ]
RNA-Seq 実験の感度と精度は、各サンプルから得られるリード数に依存します。 [ 85 ] [ 86 ] トランスクリプトームを十分にカバーし、低存在量の転写産物を検出できるようにするには、多数のリードが必要です。出力範囲が限られているシーケンス技術、シーケンス作成の効率の変動、およびシーケンス品質の変動により、実験設計はさらに複雑になります。これらの考慮事項に加えて、すべての種は異なる数の遺伝子 を持っているため、効果的なトランスクリプトームにはカスタマイズされたシーケンス収量が必要です。初期の研究では適切な閾値が経験的に決定されましたが、技術が成熟するにつれて、トランスクリプトームの飽和によって適切なカバーが計算によって予測されるようになりました。やや直感に反しますが、低発現遺伝子の差次的発現の検出を改善する最も効果的な方法は、リード数を増やすのではなく、生物学的複製数を増やすことです。 [ 87 ] DNAエレメント百科事典 (ENCODE)プロジェクトが推奨する現在のベンチマークは、標準的なRNA-Seqではエクソームカバレッジが70倍、希少な転写産物やアイソフォームを検出するにはエクソームカバレッジが最大500倍である。[ 88 ] [ 89 ] [ 90 ]
データ分析 トランスクリプトミクス法は高度に並列化されており、マイクロアレイ実験とRNA-Seq実験の両方で意味のあるデータを生成するにはかなりの計算が必要です。[ 91 ] [ 92 ] [ 93 ] [ 94 ] [ 95 ] マイクロアレイデータは高解像度 画像として記録され、特徴検出 とスペクトル分析が必要です。[ 96 ] マイクロアレイの生画像ファイルはそれぞれ約750MBのサイズですが、処理された強度は約60MBのサイズです。単一の転写産物に一致する複数の短いプローブは、イントロン -エクソン 構造の詳細を明らかにすることができ、結果として得られるシグナルの真正性を判断するために統計モデルが必要です。RNA-Seq研究では数十億の短いDNA配列が生成され、これらは数百万から数十億の塩基対で構成される参照ゲノムにアラインメントする必要があります。データセット内のリードの de novo アセンブリには、非常に複雑なシーケンスグラフ の構築が必要です。[ 97 ] RNA-Seq 操作は非常に反復的であり、並列計算 の恩恵を受けるが、最新のアルゴリズムにより、リードのde novo アセンブリを必要としない単純なトランスクリプトミクス実験には、市販のコンピューティング ハードウェアで十分である。[ 98 ] ヒトのトランスクリプトームは、サンプルあたり 3,000 万個の 100 bp シーケンスを使用して RNA-Seq で正確にキャプチャできる。[ 85 ] [ 86 ] この例では、圧縮fastq 形式で保存すると、サンプルあたり約 1.8 ギガバイトのディスク容量が必要になる。各遺伝子の処理済みカウント データははるかに小さく、処理済みマイクロアレイ強度に相当する。シーケンス データは、 Sequence Read Archive (SRA)などの公開リポジトリに保存できる。[ 99 ] RNA-Seq データセットは、Gene Expression Omnibus を介してアップロードできる。[ 100 ]
画像処理 マイクロアレイとシーケンスフローセル 。マイクロアレイとRNA-seqは、異なる方法で画像解析に依存しています。マイクロアレイチップでは、チップ上の各スポットは定義されたオリゴヌクレオチドプローブであり、蛍光強度が特定の配列の存在量を直接検出します(Affymetrix)。ハイスループットシーケンスフローセルでは、スポットは一度に1ヌクレオチドずつシーケンスされ、各ラウンドの色はシーケンス内の次のヌクレオチドを示します(Illumina Hiseq)。これらの技術の他のバリエーションでは、より多くのまたはより少ないカラーチャネルを使用します。[ 51 ] [ 101 ] マイクロアレイ画像処理では 、画像内の規則的なグリッド状 の特徴を正しく識別し、各特徴の蛍光強度を個別に定量化する必要があります。さらに、 画像アーティファクトを 識別し、全体の解析から除去する必要があります。アレイ上の各プローブの配列は既にわかっているため、蛍光強度は各配列の存在量を直接示します。[ 102 ]
RNA-seq の最初のステップにも同様の画像処理が含まれますが、画像からシーケンス データへの変換は通常、機器のソフトウェアによって自動的に処理されます。 Illumina のシーケンス合成法では、フロー セルの表面にクラスターのアレイが分布します。[ 103 ] フロー セルは、各シーケンス サイクル中に最大 4 回画像化され、合計で数十から数百のサイクルが行われます。フロー セル クラスターはマイクロ アレイ スポットに類似しており、シーケンス プロセスの初期段階で正しく識別する必要があります。Roche のパイロ シーケンス 法では、放出される光の強度によって、ホモポリマー リピート内の連続するヌクレオチドの数が決まります。これらの方法には多くのバリエーションがあり、それぞれ結果データのエラー プロファイルが異なります。[ 104 ]
RNA-Seqデータ解析 RNA-Seq実験では、大量の生のシーケンスリードが生成され、有用な情報を得るためには処理する必要があります。データ解析には通常、実験設計と目的に応じて異なるバイオインフォマティクスソフトウェアツールの組み合わせが必要です( RNA-Seqバイオインフォマティクスツールのリスト も参照)。プロセスは、品質管理、アライメント、定量化、および差次的発現の4つの段階に分けられます。[ 105 ] 最も一般的なRNA-Seqプログラムは、 Unix 環境またはR / Bioconductor 統計環境のいずれかで、コマンドラインインターフェース から実行されます。[ 94 ]
品質管理 シーケンスの読み取りは完璧ではないため、下流の解析のために、シーケンス内の各塩基の精度を推定する必要があります。生データは、塩基コールの品質スコアが高いこと、GC 含有量が期待される分布と一致すること、短いシーケンスモチーフ ( k-mer ) が過剰に表現されていないこと、およびリードの重複率が許容範囲内に低いことを確認するために検査されます。[ 86 ] シーケンス品質分析には、FastQC や FaQCs など、いくつかのソフトウェアオプションがあります。[ 106 ] [ 107 ] 異常は、後続の処理で除去 (トリミング) または特別な処理のためにタグ付けされる場合があります。
アライメント 配列リードの存在量を特定の遺伝子の発現に関連付けるために、転写産物配列は参照ゲノムにアラインメント されるか、参照がない場合は互いにde novo アラインメントされます。 [ 108 ] [ 109 ] [ 110 ] アラインメントソフトウェア の主な課題には、数十億の短い配列を意味のある時間枠でアラインメントできる十分な速度、真核生物mRNAのイントロンスプライシングを認識して処理する柔軟性、および複数の場所にマッピングされるリードの正しい割り当てが含まれます。ソフトウェアの進歩によりこれらの問題が大幅に解決され、シーケンスリード長の増加により、曖昧なリードアラインメントの可能性が減少します。現在利用可能なハイスループットシーケンスアライナーのリストはEBI によって維持されています。[ 111 ] [ 112 ]
真核生物 由来の一次転写産物mRNA 配列をリファレンスゲノムにアライメントするには、成熟mRNAには存在しないイントロン配列の特別な処理が必要です。 [ 113 ] ショートリードアライナーは、標準的なスプライス部位配列と既知のイントロンスプライス部位情報に基づいて、スプライス接合部を 識別するように特別に設計された追加のアライメントラウンドを実行します。イントロンスプライス接合部を識別することで、リードがスプライス接合部をまたいで誤ってアライメントされたり、誤って破棄されたりするのを防ぎ、より多くのリードをリファレンスゲノムにアライメントして、遺伝子発現推定の精度を向上させることができます。遺伝子調節は mRNAアイソフォーム レベルで起こる可能性があるため、スプライスを考慮したアライメントは、バルク解析では失われる可能性のあるアイソフォーム存在量の変化を検出することも可能にします。[ 114 ]
デノボ アセンブリは、参照ゲノムを使用せずにリードを互いに整列させて全長転写産物配列を構築するために使用できます。[ 115 ] デノボ アセンブリ特有の課題には、参照ベースのトランスクリプトームと比較して計算要件が大きいこと、遺伝子変異体または断片の追加検証、およびアセンブルされた転写産物の追加アノテーションが含まれます。N50 など、トランスクリプトームアセンブリを記述するために最初に使用された指標は誤解 を招くことが示されており[ 116 ] 、現在では改良された評価方法が利用可能です。[ 117 ] [ 118 ] アノテーションベースの指標は、コンティグ 相互ベストヒット数など、アセンブリの完全性をより適切に評価します。デノボで アセンブリが完了すると、アセンブリは、後続の配列整列方法および定量的遺伝子発現解析の参照として使用できます。
凡例:RAM – ランダムアクセスメモリ、MPI – メッセージパッシングインターフェース、EST – 表現シーケンスタグ。
定量化 異なるサンプル間での遺伝子共発現パターンのヒートマップによる 識別。各列には、単一サンプルの遺伝子発現変化の測定値が含まれています。相対的な遺伝子発現は色で示されます。高発現(赤)、中発現(白)、低発現(青)。類似の発現プロファイルを持つ遺伝子とサンプルは自動的にグループ化できます(左と上のツリー)。サンプルは、異なる個人、組織、環境、または健康状態である可能性があります。この例では、サンプル 1、2、および 3 で遺伝子セット 1 の発現が高く、遺伝子セット 2 の発現が低いです。 [ 51 ] [ 129 ] 配列アライメントの定量化は、遺伝子、エクソン、または転写産物レベルで実行できます。[ 91 ] [ 87 ] 一般的な出力には、ソフトウェアに提供された各フィーチャーのリードカウントのテーブルが含まれます。たとえば、一般的なフィーチャー形式 ファイルの遺伝子の場合です。たとえば、HTSeq を使用すると、遺伝子とエクソンのリードカウントを簡単に計算できます。[ 130 ] 転写産物レベルでの定量化はより複雑で、短いリード情報から転写産物アイソフォームの存在量を推定するために確率的方法が必要です。たとえば、cufflinks ソフトウェアを使用します。[ 114 ] 複数の場所に同様によくアライメントされるリードは識別され、削除するか、可能な場所の 1 つにアライメントするか、最も可能性の高い場所にアライメントする必要があります。
定量化手法の中には、リードをリファレンス配列に正確にアライメントする必要性を全くなくすものがある。kallistoソフトウェアの手法は、擬似アライメントと定量化を単一のステップに組み合わせ、tophat/cufflinksソフトウェアなどで使用されている手法よりも2桁速く、計算負荷も少ない。[ 131 ]
差次的発現 各転写産物の定量的カウントが利用可能になったら、データの正規化、モデリング、統計分析によって差次的遺伝子発現が測定されます。 [ 108 ] ほとんどのツールは、入力として遺伝子とリードカウントのテーブルを読み込みますが、cuffdiff などの一部のプログラムは、バイナリアライメントマップ 形式のリードアライメントを入力として受け入れます。これらの分析の最終出力は、処理間の差次的発現に対する関連するペアワイズ検定と、それらの差の確率推定値を含む遺伝子リストです。[ 132 ]
凡例:mRNA - メッセンジャーRNA。
トランスクリプトームデータベース トランスクリプトミクス研究では、実験の当初の目的をはるかに超えた応用が可能な大量のデータが生成されます。そのため、生データまたは処理済みデータは、より広範な科学コミュニティでの有用性を確保するために、公共データベース に保存されることがあります。たとえば、2018年時点で、Gene Expression Omnibusには数百万件の実験データが含まれていました。[ 166 ]
凡例:NCBI – 米国国立生物工学情報センター、EBI – 欧州バイオインフォマティクス研究所、DDBJ – 日本DNAデータバンク、ENA – 欧州ヌクレオチドアーカイブ、MIAME – マイクロアレイ実験に関する最小情報、MINSEQE – ハイスループットヌクレオチドシーケンス実験に関する最小情報。
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