De novo トランスクリプトーム アセンブリ

デノボトランスクリプトームアセンブリは、参照ゲノムの助けを借りずにトランスクリプトームを作成するデノボ配列アセンブリ法です。

新たなシーケンシング技術の開発の結果、2008年から2012年にかけてシーケンシングのコストは大幅に低下しました。メガベースおよびゲノムあたりのコストは、それぞれ10万分の1および1万分の1に低下しました。^[1]これ以前は、科学研究に広く関心と有用性がある生物のトランスクリプトームのみがシーケンシングされていましたが、2010年代に開発されたハイスループットシーケンシング（次世代シーケンシングとも呼ばれる）技術は、コスト効率と労力効率の両方に優れており、これらの方法で研究される生物の範囲は拡大しています。^[2]その後、ヒヨコマメ、^[3] プラナリア、^[4] ハワイアンプラナリア、^[5]ナイルワニ、コーンスネーク、アゴヒゲトカゲ、ミシシッピアカミミガメの脳など、数多くの生物のトランスクリプトームが作成されました。^[6]

非モデル生物を調べることで、地球上の生命の豊かさを可能にした「魅力的な形態学的革新の多様性」の根底にあるメカニズムについて新たな洞察が得られる可能性がある。^[7]動物や植物では、一般的なモデル生物では調べられない「革新」には、擬態、共生、寄生、無性生殖などがある。非モデル生物の研究には、ゲノムを構築するよりも安価で簡単であり、既存のゲノムがなければ参照ベースの方法は不可能であるため、デノボトランスクリプトームアセンブリが好まれることが多い。したがって、これらの生物のトランスクリプトームは、このようなユニークな生物学的現象に関係する新しいタンパク質とそのアイソフォームを明らかにすることができる。

組み立てられた転写産物のセットにより、遺伝子発現の初期研究が可能になります。トランスクリプトームアセンブリコンピュータプログラムが開発される前は、トランスクリプトームデータは主に参照ゲノムにマッピングすることによって分析されていました。ゲノムアラインメントは転写産物配列を特徴付ける堅牢な方法ですが、この方法は、選択的スプライシングなどのmRNA転写産物の構造変化の発生を考慮できないという欠点があります。^[8]ゲノムには、転写産物に存在する可能性のあるすべてのイントロンとエクソンの合計が含まれているため、ゲノムに沿って連続的に整列しないスプライスバリアントは、実際のタンパク質アイソフォームとして無視される場合があります。参照ゲノムが利用できる場合でも、参照ゲノムアセンブリから欠落しているゲノムのセグメントから転写された転写産物を回復できるため、 de novoアセンブリを実行する必要があります。^[9]

ゲノム配列カバレッジレベルは、DNAの非コードイントロン領域の反復内容の結果としてランダムに変化する可能性があるが、トランスクリプトーム配列カバレッジレベルは、遺伝子発現レベルを直接示すことができる。これらの反復配列は、ゲノムアセンブリにおけるコンティグの形成にも曖昧さを生み出すが、トランスクリプトームアセンブリコンティグの曖昧さは通常、スプライスされたアイソフォーム、または遺伝子ファミリーのメンバー間の小さな変異に対応する。^[8]ゲノムアセンブラーは、いくつかの理由からトランスクリプトームアセンブリに直接使用できない。第1に、ゲノムシーケンシングの深度は通常ゲノム全体で同じであるが、転写産物の深度は異なる可能性がある。第2に、ゲノムシーケンシングでは常に両方の鎖がシーケンシングされるが、RNA-seqは鎖特異的である可能性がある。第3に、同じ遺伝子からの転写産物バリアントはエクソンを共有する可能性があり、明確に解決するのが難しいため、トランスクリプトームアセンブリはより困難である。^[9]

細胞からRNAを抽出して精製すると、高スループットシーケンシング施設に送られ、そこでまず逆転写されてcDNAライブラリが作成されます。このcDNAは、シーケンシングに使用するプラットフォームに応じて、さまざまな長さに断片化できます。454 Sequencing、Illumina、SOLiDの各プラットフォームは、それぞれ異なるタイプの技術を使用して、何百万もの短い読み取りをシーケンシングします。

cDNA シーケンスの読み取りは、ショート リード トランスクリプト アセンブリ プログラムによってトランスクリプトに組み立てられます。おそらく、トランスクリプト間でのアミノ酸の変異は、他の点では類似していますが、異なるタンパク質アイソフォームを反映しています。また、変異の程度に応じて、同じ遺伝子ファミリー内の異なる遺伝子、または保存されたドメインのみを共有する遺伝子を表す可能性もあります。

多数のアセンブリプログラムが利用可能である（アセンブラーを参照）。これらのプログラムはゲノムのアセンブリでは一般的に成功しているが、トランスクリプトームアセンブリにはいくつかの特有の課題がある。ゲノムの配列カバレッジが高いことは反復配列の存在を示している可能性がある（したがってマスクされている）が、トランスクリプトームの場合は豊富さを示している可能性がある。さらに、ゲノムシーケンシングとは異なり、トランスクリプトームシーケンシングはセンス転写とアンチセンス転写の両方の可能性があるため、鎖特異的である可能性がある。最後に、すべてのスプライシングアイソフォームを再構築して分離することは困難な場合がある。^[9]

ショートリードアセンブラは、一般的にオーバーラップグラフとデ・ブリュイングラフの2つの基本アルゴリズムのいずれかを使用します。^[10]オーバーラップグラフは、サンガーシーケンスリード用に設計されたほとんどのアセンブラで利用されています。各リードペア間のオーバーラップが計算され、各ノードが単一のシーケンスリードを表すグラフにコンパイルされます。このアルゴリズムはデ・ブリュイングラフよりも計算集約的であり、より少ないリードを高いオーバーラップ度でアセンブルするのに最も効果的です。^[10] デ・ブリュイングラフは、 k-1シーケンス保存に基づいてk-mer （通常25〜50 bp）をアラインメントしてコンティグを作成します。k-merはリード長よりも短いため、高速ハッシュが可能になり、デ・ブリュイングラフでの操作は一般的に計算集約的ではありません。^[10]

組み立てられた転写産物の機能的注釈により、推定タンパク質が関与する特定の分子機能、細胞成分、生物学的プロセスについての洞察が得られます。Blast2GO (B2G) は、遺伝子オントロジーベースのデータマイニングにより、GO 注釈がまだ利用できない配列データに注釈を付けることを可能にします。これは、非モデル種の機能ゲノミクス研究でよく使用される研究ツールです。^{[11]これは、組み立てられたコンティグを非冗長タンパク質データベース (NCBI にある) に対して}ブラストし、配列の類似性に基づいて注釈を付けることで機能します。GOanna は、動物および農業植物の遺伝子産物に特化した別の GO 注釈プログラムで、同様の方法で機能します。これは、GO 注釈および分析用の、キュレーションされた公開アクセス可能な計算ツールスイートの AgBase データベースの一部です。^[12]注釈の後、KEGG (京都遺伝子ゲノム百科事典) により、トランスクリプトームにキャプチャされた代謝経路と分子相互作用ネットワークを視覚化できます。^[13]

コンティグは、GO 用語の注釈が付けられるだけでなく、オープン リーディング フレーム(ORF) のスクリーニングも行われ、これらの転写産物から得られるタンパク質のアミノ酸配列を予測できます。別のアプローチとして、タンパク質ドメインに注釈を付け、特定の遺伝子ではなく遺伝子ファミリーの存在を判定する方法があります。

十分に解像された参照ゲノムが利用できることはまれであるため、コンピュータで組み立てられたコンティグの品質は、組み立てられた配列をそれらの生成に使用されたリードと比較する（参照なし）か、mRNA転写産物で見つかった保存された遺伝子ドメインの配列を近縁種のトランスクリプトームまたはゲノムにアラインメントする（参照ベース）ことによって検証される。Transrate ^[14]や DETONATE ^[15]などのツールを使用すると、これらの方法によるアセンブリ品質の統計分析が可能になる。別の方法としては、予測された転写産物のPCRプライマーを設計し、cDNAライブラリからそれらを増幅してみるという方法がある。多くの場合、例外的に短いリードは除外される。短い配列（< 40アミノ酸）は、独立して折り畳まれて疎水性コアを形成することができないため、機能的なタンパク質を表す可能性は低い。^[16]

これらの指標を補完するものとして、遺伝子含有量の定量的評価は、アセンブリの品質に関するさらなる洞察を提供する可能性がある。このステップを実行するには、BUSCO ^[17]などの保存遺伝子に基づいて予想される遺伝子空間をモデル化するツールを使用することができる。真核生物の場合、CEGMA ^[18]も使用できるが、2015年以降は公式にはサポートされていない。^[19]

以下は、トランスクリプトームを生成するために使用され、科学文献でも引用されているアセンブリ ソフトウェアの概要の一部です。

SOAPdenovo-Trans は、 SOAPdenovo2 フレームワークから継承されたde novoトランスクリプトーム アセンブラーであり、選択的スプライシングと異なる発現レベルでトランスクリプトームをアセンブルするように設計されています。このアセンブラーは、SOAPdenovo2 と比較して、完全長トランスクリプト セットを構築するためのより包括的な方法を提供します。

Velvetアルゴリズムは、de Bruijnグラフを使用して転写産物を組み立てます。シミュレーションでは、Velvetは原核生物データと哺乳類細菌人工染色体（BAC）の3kb N50を使用して、最大50kb N50長のコンティグを生成できます。 ^{[20]これらの予備転写産物は}Oasesに転送され、ペアエンドリードとロングリード情報を使用して転写産物アイソフォームが構築されます。^[21]

ABySS は並列ペアエンド配列アセンブラです。Trans-ABySS (Assembly By Short Sequences) は、 ABySS でアセンブルされたトランスクリプトームコンティグを解析するためのPythonとPerlで書かれたソフトウェアパイプラインです。このパイプラインは、幅広い k 値で生成されたアセンブリに適用できます。まず、データセットを冗長性のないコンティグの小さなセットに縮小し、エクソンスキッピング、新規エクソン、保持されたイントロン、新規イントロン、および代替スプライシングなどのスプライシングイベントを識別します。Trans-ABySS アルゴリズムは、遺伝子発現レベルを推定し、潜在的なポリアデニル化部位、および候補遺伝子融合イベントを識別することもできます。^[22]

Trinity ^[23]は、まず配列データを複数のde Bruijnグラフに分割し、各グラフは単一の遺伝子または遺伝子座における転写変異を表します。次に、全長スプライシングアイソフォームを抽出し、各グラフからパラロガス遺伝子に由来する転写産物を個別に区別します。Trinityは3つの独立したソフトウェアモジュールで構成されており、転写産物を生成するために順番に使用されます。

• Inchworm はRNA-Seq データを転写シーケンスに組み立て、多くの場合、主要なアイソフォームの完全長転写産物を生成しますが、その後、選択的スプライシングされた転写産物の固有の部分のみを報告します。
• Chrysalis はInchworm コンティグをクラスター化し、各クラスターの完全な de Bruijn グラフを構築します。各クラスターは、特定の遺伝子 (または保存された配列を共有する遺伝子ファミリーまたは遺伝子セット) の完全な転写複雑性を表します。次に、Chrysalis は完全なリードセットをこれらの個別のグラフに分割します。
• バタフライは個々のグラフを並列に処理し、グラフ内の読み取りパスをトレースし、最終的に選択的スプライシングアイソフォームの完全長転写産物を報告し、パラロガス遺伝子に対応する転写産物を分離します。^[24]

• トランスクリプトーム
• トランスクリプトミクス
• 選択的スプライシングのためのヒトトランスクリプトームデータベース(H-DBAS)
• ユニジーン
• 完全寄生虫
• エクソームシークエンシング