逆ノーザンブロット

リバースノーザンブロットは、試験サンプルから単離されたRNA分子を対照cDNAライブラリのサンプルと比較することによって遺伝子発現パターンを分析する方法である。これはノーザンブロットの変形であり、膜上に固定化された核酸はRNAではなく単離されたDNA断片の集合であり、プローブは組織から抽出され放射性標識されたRNAである。リバースノーザンブロットは、組織内の特定のRNA配列セットの発現レベルをプロファイルしたり、サンプル内の特定のRNA配列の存在を判定したりするために使用できる。^[1] DNAマイクロアレイやより新しい次世代技術が一般的にリバースノーザンブロットに取って代わったが、今日でもまだ利用されており、大規模な遺伝子セットの発現を定義する比較的安価で簡単な手段を提供している。

手順

逆ノーザン膜を作製するために、目的の転写産物の cDNA 配列をナイロン膜に固定する。これは、ドットブロットまたは双方向アガロースゲルブロッティングと膜への DNA の UV 固定によって達成できる。多くの場合、RNA 分解酵素または組織代謝物による RNA 分解の問題を軽減するために、RNA プローブよりも cDNA プローブが好まれる。^[2]作製した逆ノーザンブロット膜は、SSC 緩衝液を含むデンハルト溶液でプレハイブリダイズされ、標識 cDNA プローブは 100 °C で変性され、プレハイブリダイゼーション溶液に添加される。膜はプローブとともに 65 °C で少なくとも 15 時間インキュベートされ、その後洗浄されて露光される。^[3]

アプリケーション

mRNA発現レベルの定量化

テスターサンプルとSSHライブラリからのcDNAを使用した一般的な逆ノーザンブロット法。テスターサンプルの転写産物の過剰発現は、膜上に暗い点として現れます。

リバースノーザンブロットは、そのベースとなるノーザンブロットとよく似ており、特定の組織における遺伝子発現のレベルを決定するために使用されます。ノーザンブロットと比較すると、リバースノーザンブロットは、ノーザンブロットに必要なプローブの特異性よりも低い特異性で、一度に多数の転写産物をプローブできます。^{[4]多くの場合、}抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション (SSH)ライブラリまたはディファレンシャルディスプレイを使用して、差次的に発現した転写産物を分離し、これらの配列の挿入を含む細菌クローンを作成します。これらは膜にハイブリダイズするターゲットとして機能し、サンプル RNA によってプローブされます。発現レベルは、コントロール処理に対する蛍光または放射性シグナルの増減によって定量化できます。^[3]より暗く大きく見えるバンドまたはドットは、対象のサンプルで過剰発現している転写産物を示し、より明るいドットは、転写産物がコントロールサンプルに対してダウンレギュレーションされていることを示します。

差分表示結果の確認

バンドに異種配列が混入することで偽陽性が多数発生する傾向があるため、差次的表示ヒットは差次的発現を決定する別の方法で確認する必要がある。^[5]結果を確認するためにノーザンブロットやq-PCRがよく使用されるが、どちらの手法にも欠点がある。ノーザンブロットは一度に1つのmRNAしかプローブできないという制限があるが、q-PCRでは配列のプライマーを生成するのに十分な長さの転写産物が必要であり、プローブは高価になる可能性がある。そのため、DD-PCRからのヒット、または発現レベルが変化した配列を確認する1つの方法としてリバースノーザンが使用されている。この場合、メンブレンはベクターにクローニングされ、配列決定され、再増幅された増幅DD-PCR産物でコーティングされる。^[4]

DNAマイクロアレイ

DNAマイクロアレイは、リバースノーザンブロット法で用いられるものと同様の手順で動作し、多数のDNAプローブが固体ガラス、プラスチック、またはシリコン基板にハイブリダイズされ、標識RNAまたはcDNAでプローブされる。これにより、遺伝子発現プロファイリングが大幅に拡張される。^[6]アレイは、研究ニーズ（癌、細胞周期、または毒物学マイクロアレイなど）に合わせて商業サプライヤーから購入することも、カスタムターゲット用に生成することもできる。^[7]単離サンプルcDNAプローブのハイブリダイゼーションによって生成される蛍光または放射性シグナルは、研究対象組織における転写産物の量に比例する。^[8]

研究アプリケーション

2013 年にGene 誌に掲載された研究では、リバースノーザンブロット法が使用され、著者は耐寒性柑橘類Poncirus trifoliata の早期耐寒性反応に関与する遺伝子をいくつか特定しました。抑制サブトラクティブハイブリダイゼーションライブラリは、耐寒性処理植物と対照植物から作成され、cDNA クローンは配列決定され、対照植物と耐寒性処理植物の両方から DIG 標識 cDNA でプローブされた膜にハイブリダイズされました。特に強いアップレギュレーションが見られた遺伝子には、細胞救済と防御、細胞代謝、転写調節の遺伝子が含まれていました。これには、光合成酵素 RuBisCO を制御するリブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼアクチバーゼ、解糖と酸化ストレス反応に関与する GAPDH、細胞分裂制御タンパク質 CDC91、および NBS-LLR 病害抵抗性遺伝子が含まれます。これらの結果は、qPCR によって確認されました。^[9]
ある研究では、ラットにハンチントン病のような表現型を生じさせる実験でよく使われる 3-NP を投与されたラットの線条体組織の違いを調べるためにこの技術が利用されました。遺伝子の過剰発現と過少発現のプロファイルを作成するために、順方向および逆方向抑制サブトラクティブハイブリダイゼーションが使用され、これらのライブラリは 2 つの膜にブロットされました。解剖されたラットの脳に同様の病変が見られることに加え、研究グループは線条体でプロフィリン 2 (Pfn2) の発現が著しく増加していることを確認しました。その過剰発現は、アクチン重合の減少と、その結果として樹状突起棘密度の低下につながります。^[10]

参照

参考文献

^ Primrose, Sandy B.; Twyman, Richard (2009-04-01). ゲノム解析とゲノミクスの原理. John Wiley & Sons. ISBN 9781444311280。
^ Jaakola, Laura (2001). 「CDNAブロッティングは遺伝子発現研究の代替手段となる」. Plant Molecular Biology Reporter . 19 (2): 125– 128. doi :10.1007/BF02772154. S2CID 22160714.
^ ab ボウラー、クリス博士（2002-01-01）。分子植物生物学：実践的アプローチ。オックスフォード大学出版局。ISBN 9780199638185。
^ ab Dilks, Daniel W; Ring, Robert H; Khawaja, Xavier Z; Novak, Thomas J; Aston, Christopher (2003-02-15). 「リバースノーザンブロッティングを用いたディファレンシャルディスプレイPCR結果のハイスループット確認」Journal of Neuroscience Methods . 123 (1): 47– 54. CiteSeerX 10.1.1.333.8554 . doi :10.1016/S0165-0270(02)00343-6. PMID 12581848. S2CID 6174017.
^ Callard, D.; Lescure, B.; Mazzolini, L. (1994). 「mRNA 差分表示技術によって生成される偽陽性を排除する方法」BioTechniques . 16 (6): 1096– 7, 1100– 3. PMID 7521188.
^ Tomar, Rukam S. (2010-01-15). 分子マーカーと植物バイオテクノロジー。New India Publishing。ISBN 9789380235257。
^ Kurnaz, Isil Aksan (2015-05-08). 遺伝子工学の技術. CRC Press. ISBN 9781482260908。
^ Offermanns, Stefan (2008-08-14). 分子薬理学百科事典. Springer Science & Business Media. ISBN 9783540389163。
^ Şahin-Çevik, Mehtap (2013-01-10). 「耐寒性柑橘類近縁種Poncirus trifoliata (L.) Rafの早期寒冷誘導遺伝子の同定と発現解析」. Gene . 512 (2): 536– 545. doi :10.1016/j.gene.2012.09.084. PMID 23026217.
^ Chakraborty, J.; Pandey, M.; Navneet, AK; Appukuttan, TA; Varghese, M.; Sreetama, SC; Rajamma, U.; Mohanakumar, KP (2014). 「ラットの3-ニトロプロピオン酸誘発ハンチントン病の線条体におけるプロフィリン-2の発現増加とβ-アクチンとの相互作用の変化」Neuroscience . 281 : 216– 228. doi :10.1016/j.neuroscience.2014.09.035. PMID 25255934. S2CID 5289485.

外部リンク

発現の差分表示、逆ノーザンおよびqPCR分析のプロトコル
ディファレンシャルディスプレイによる遺伝子発現の違いのスクリーニング
さまざまな遺伝子発現解析手法を説明するプレゼンテーション

[1] Primrose, Sandy B.; Twyman, Richard (2009-04-01). ゲノム解析とゲノミクスの原理. John Wiley & Sons. ISBN 9781444311280。

[2] Jaakola, Laura (2001). 「CDNAブロッティングは遺伝子発現研究の代替手段となる」. Plant Molecular Biology Reporter . 19 (2): 125– 128. doi :10.1007/BF02772154. S2CID 22160714.

[:0-3] ボウラー、クリス博士（2002-01-01）。分子植物生物学：実践的アプローチ。オックスフォード大学出版局。ISBN 9780199638185。

[:1-4] Dilks, Daniel W; Ring, Robert H; Khawaja, Xavier Z; Novak, Thomas J; Aston, Christopher (2003-02-15). 「リバースノーザンブロッティングを用いたディファレンシャルディスプレイPCR結果のハイスループット確認」Journal of Neuroscience Methods . 123 (1): 47– 54. CiteSeerX 10.1.1.333.8554 . doi :10.1016/S0165-0270(02)00343-6. PMID 12581848. S2CID 6174017.

[5] Callard, D.; Lescure, B.; Mazzolini, L. (1994). 「mRNA 差分表示技術によって生成される偽陽性を排除する方法」BioTechniques . 16 (6): 1096– 7, 1100– 3. PMID 7521188.

[6] Tomar, Rukam S. (2010-01-15). 分子マーカーと植物バイオテクノロジー。New India Publishing。ISBN 9789380235257。

[7] Kurnaz, Isil Aksan (2015-05-08). 遺伝子工学の技術. CRC Press. ISBN 9781482260908。

[8] Offermanns, Stefan (2008-08-14). 分子薬理学百科事典. Springer Science & Business Media. ISBN 9783540389163。

[9] Şahin-Çevik, Mehtap (2013-01-10). 「耐寒性柑橘類近縁種Poncirus trifoliata (L.) Rafの早期寒冷誘導遺伝子の同定と発現解析」. Gene . 512 (2): 536– 545. doi :10.1016/j.gene.2012.09.084. PMID 23026217.

[10] Chakraborty, J.; Pandey, M.; Navneet, AK; Appukuttan, TA; Varghese, M.; Sreetama, SC; Rajamma, U.; Mohanakumar, KP (2014). 「ラットの3-ニトロプロピオン酸誘発ハンチントン病の線条体におけるプロフィリン-2の発現増加とβ-アクチンとの相互作用の変化」Neuroscience . 281 : 216– 228. doi :10.1016/j.neuroscience.2014.09.035. PMID 25255934. S2CID 5289485.