イルミナ色素シーケンシング

イルミナ色素シーケンシングは、 DNAの塩基対の配列を決定するために使用される技術であり、 DNAシーケンシングとしても知られています。可逆的終結化学概念は、パリのパスツール研究所のブルーノ・カナールとサイモン・サルファティによって発明されました。^{[1] [2]}これは、ケンブリッジ大学のシャンカール・バラスブラマニアンとデビッド・クレナーマンによって開発され、 ^[3]その後、イルミナに買収された会社であるソレクサを設立しました。このシーケンシング方法は、DNA鎖上で洗浄される単一のヌクレオチドの識別を可能にする可逆的色素ターミネーターに基づいています。また、全ゲノムおよび領域シーケンシング、トランスクリプトーム分析、メタゲノミクス、小さなRNAの発見、メチル化プロファイリング、およびゲノム全体のタンパク質-核酸相互作用分析にも使用できます。^{[4] [5]}

これは、増幅、配列決定、分析という 3 つの基本的なステップで機能します。プロセスは、精製された DNA から始まります。DNA は断片化され、増幅、配列決定、分析中に参照ポイントとして機能するセグメントを含むアダプターが追加されます。変更された DNA は、増幅と配列決定が行われるフローセルにロードされます。フローセルには、断片の間隔を空けて過密状態を防ぐナノウェルが含まれています。^[6]各ナノウェルには、アダプターが接続するためのアンカー ポイントを提供するオリゴヌクレオチドが含まれています。断片が接続されると、クラスター生成と呼ばれるフェーズが開始されます。このステップでは、各 DNA 断片のコピーが約 1,000 個作成され、ブリッジ増幅PCRによって実行されます。次に、プライマーと変更されたヌクレオチドがチップ上に洗い流されます。これらのヌクレオチドには可逆的な蛍光ブロッカーがあるため、DNA ポリメラーゼは一度に 1 つのヌクレオチドしか DNA 断片に追加できません。^[6] 合成の各ラウンドの後、カメラがチップの写真を撮影します。コンピューターは、蛍光タグの波長によって追加された塩基を決定し、チップ上のすべてのスポットに記録します。各ラウンドの後に、組み込まれなかった分子は洗い流されます。次に、化学的な脱ブロッキングステップを使用して、3'蛍光末端ブロッキング基を除去します。このプロセスは、DNA分子全体が配列決定されるまで続きます。^{[5]この技術により、ゲノム全体の何千もの場所が、}大規模な並列シーケンシングによって一度に配列決定されます。

DNA を精製した後、DNA ライブラリ、つまりゲノムライブラリを生成する必要があります。ゲノムライブラリを生成するには、超音波処理とタグメンテーションの 2 つの方法があります。タグメンテーションでは、トランスポザーゼがDNA を 50 ～ 500 bp の断片にランダムに切断し、同時にアダプターを追加します。^[6] 遺伝子ライブラリは、超音波処理を使用してゲノム DNA を断片化することによっても生成できます。超音波処理では、超音波を使用して DNA を同様のサイズに断片化します。超音波処理後、T7 DNA ポリメラーゼと T4 DNA リガーゼによって右と左のアダプターを結合する必要があります。アダプターが結合されなかった鎖は洗い流されます。^[7]

アダプターには、固体支持体（フローセル上のオリゴヌクレオチド）に相補的な配列、バーコード配列（インデックス）、およびシーケンシングプライマーの結合部位の 3 つの異なるセグメントが含まれています。^[6] インデックスは通常 6 塩基対の長さで、DNA 配列分析中にサンプルを識別するために使用されます。インデックスを使用すると、最大 96 個の異なるサンプルを一緒に実行できます。これはマルチプレックス化とも呼ばれます。分析中、コンピューターは同じインデックスを持つすべての読み取りをグループ化します。^{[8] [9]} Illumina は「合成によるシーケンス」アプローチを使用します。^[9]このプロセスは、アクリルアミドでコーティングされたガラスフローセル内で行われます。^[10]フローセルには、セルの底をコーティングしたオリゴヌクレオチド（短いヌクレオチド配列）があり、シーケンシング中に DNA 鎖を所定の位置に保持する固体支持体として機能します。断片化された DNA がフローセル上で洗浄されると、適切なアダプターが相補的な固体支持体に付着します。

結合したら、クラスター生成を開始できます。目標は、何百もの同一の DNA 鎖を作成することです。いくつかは順方向鎖で、残りは逆方向鎖になります。これが、右アダプターと左アダプターが使用される理由です。クラスターはブリッジ増幅によって生成されます。DNA ポリメラーゼは DNA 鎖に沿って移動し、その相補鎖を作成します。元の鎖は洗い流され、逆方向鎖のみが残ります。逆方向鎖の上部にはアダプター配列があります。DNA 鎖は曲がり、上部のアダプター配列に相補的なオリゴに結合します。ポリメラーゼは逆方向鎖に結合し、その相補鎖 (元の鎖と同一) が作成されます。これで二重鎖になった DNA は変性し、各鎖がフローセルに固定されたオリゴヌクレオチド配列に別々に結合できるようになります。1 つが逆方向鎖、もう 1 つが順方向鎖になります。このプロセスはブリッジ増幅と呼ばれ、フローセル全体の何千ものクラスターに対して一度に発生します。^[11]

DNA 鎖は何度も何度も曲がって固体支持体に付着します。DNA ポリメラーゼは新しい鎖を合成して二本鎖セグメントを作成し、それが変性して 1 つの領域内のすべての DNA 鎖が単一のソースからのものになります (クローン増幅)。クローン増幅は品質管理の目的で重要です。鎖に奇妙な配列が見つかった場合、科学者は逆鎖をチェックして、同じ奇妙さの補完物であることを確認できます。フォワード鎖とリバース鎖は、アーティファクトを防ぐためのチェックとして機能します。イルミナのシーケンシングでは DNA ポリメラーゼを使用するため、^[12]特に 3' 末端で塩基置換エラーが観察されています。^[13]ペアエンドの読み取りとクラスター生成を組み合わせると、エラーが発生したことを確認できます。逆鎖と順鎖は互いに補完的である必要があり、すべての逆読み取りは互いに一致し、すべての順方向読み取りは互いに一致する必要があります。読み取り結果が対応する部分（クローンであるはずの部分）と十分に類似していない場合、エラーが発生している可能性があります。一部の研究室の分析では、97%の類似性の最小閾値が使用されています。^[13]

クローン増幅の最後に、逆鎖はすべてフローセルから洗い流され、順鎖のみが残ります。プライマーは順鎖アダプタープライマー結合部位に付着し、ポリメラーゼは蛍光タグ付きdNTPをDNA鎖に追加します。蛍光体がブロッキング基として機能するため、1ラウンドあたり1塩基のみを追加できますが、ブロッキング基は可逆的です。^[6] 4色化学反応を使用すると、4つの塩基のそれぞれが固有の発光を持ち、各ラウンドの後に、どの塩基が追加されたかを機械が記録します。色が記録されると、蛍光体が洗い流され、別のdNTPがフローセル上で洗い流され、プロセスが繰り返されます。

NextSeq とその後の MiniSeq の発売に始まり、Illumina は新しい 2 色シーケンシング化学を導入しました。ヌクレオチドは、2 色 (赤または緑)、無色 (「黒」)、または両方の色の組み合わせ (赤と緑が混ざったオレンジ色で表示) のいずれかで区別されます。

DNA 鎖が読み取られると、追加されたばかりの鎖は洗い流されます。次に、インデックス 1 プライマーが結合し、インデックス 1 配列を重合し、洗い流されます。鎖は再びブリッジを形成し、DNA 鎖の 3' 末端がフローセル上のオリゴに結合します。インデックス 2 プライマーが結合し、配列を重合し、洗い流されます。

ポリメラーゼは、アーチ型鎖の上にある相補鎖を配列します。それらは分離し、各鎖の 3' 末端はブロックされます。前方鎖は洗い流され、逆方向鎖に対して合成による配列決定のプロセスが繰り返されます。

シーケンシングは一度に何百万ものクラスターに対して行われ、各クラスターにはDNAインサートの約1,000個の同一コピーが含まれます。^{[12]配列データは、}コンティグと呼ばれる重複領域を持つ断片を見つけて並べることで分析されます。参照配列がわかっている場合は、コンティグをそれと比較して変異体を識別します。

この断片的なプロセスにより、断片化されていない配列が実行されていなくても、科学者は完全な配列を見ることができます。しかし、イルミナのリード長はそれほど長くないため^[13]（HiSeqシーケンシングでは約90 bpのリード長を生成できます^[8]）、短いタンデムリピート領域を解決するのは困難です。^{[8] [12]}また、配列がde novoで参照が存在しない場合、繰り返し領域は配列アセンブリに大きな困難をもたらす可能性があります。^[12]追加の困難には、不正確なポリメラーゼによる塩基置換（特にリードの3'末端で^[13]）、キメラ配列、PCRバイアスがあり、これらはすべて誤った配列の生成に寄与する可能性があります。^[13]

この技術は、サンガーシーケンシングなどの従来のシーケンシング方法に比べていくつかの利点がある。サンガーシーケンシングでは、フォワードプライマー用とリバースプライマー用の2つの反応が必要である。イルミナとは異なり、サンガーシーケンシングでは蛍光標識されたジデオキシヌクレオシド三リン酸（ddNTP）を使用してDNA断片の配列を決定する。ddNTPは3' OH基を欠いており、DNA合成を永久に停止させる。^[6] 各反応チューブには、DNAポリメラーゼとプライマーに加えて、dNTPとddNTPが追加される。テンプレートDNAは完全に合成される必要があり、ddNTPが多すぎるとDNAテンプレートと同じサイズと位置の断片が複数作成されるため、ddNTPとdNTPの比率が重要になる。DNAポリメラーゼがddNTPを追加すると断片が停止し、新しい断片が合成される。合成される各断片は、前の断片より1ヌクレオチド長くなる。 DNA テンプレートが完全に合成されると、断片はキャピラリー電気泳動によって分離されます。キャピラリー チューブの底でレーザーが蛍光標識された ddNTP を励起し、カメラが発せられた色をキャプチャします。

イルミナの色素シーケンシングは自動化されているため、一度に複数の鎖をシーケンシングし、実際のシーケンシングデータを素早く得ることができます。サンガーシーケンシングでは、一度に1本の鎖しかシーケンシングできず、比較的時間がかかります。イルミナは、他のシーケンシング技術（例：ピロシーケンシング）で必要とされる複数の高価な酵素ではなく、DNAポリメラーゼのみを使用します。^[14]