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リアルタイムPCR（定量的に用いる場合はqPCR ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ PCR）に基づく分子生物学の実験手法です。従来のPCRのようにPCRの終了時ではなく、PCRの進行中（つまりリアルタイムで）に標的DNA分子の増幅をモニタリングします。リアルタイムPCRは、定量的にも半定量的にも（つまり、一定量以上のDNA分子かそれ以下のDNA分子かに応じて）使用できます。
リアルタイムPCRにおけるPCR産物の検出には、(1)あらゆる二本鎖DNAにインターカレーションする非特異的な蛍光色素と、(2)蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的なDNAプローブの2つの一般的な方法がある。後者は、プローブが相補的な配列とハイブリダイズした後にのみ検出を可能にする。
スティーブン・バスティン教授、ミカエル・クビスタ教授、マイケル・ファッフル教授らが執筆した定量的リアルタイムPCR実験の発表に必要な最小限の情報（MIQE ）ガイドラインでは、定量的リアルタイムPCRにはqPCRという略語を、逆転写qPCRにはRT-qPCRという略語を使用することを提案している。[ 1 ]一般的に「RT-PCR」という頭字語は、リアルタイムPCRではなく逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
すべての生物の細胞は、遺伝子転写産物（一本鎖RNA ）のターンオーバーによって遺伝子発現を調節します。細胞内で発現している遺伝子の量は、サンプル中に存在するその遺伝子のRNA転写産物のコピー数によって測定できます。少量のRNAから遺伝子発現を確実に検出および定量化するには、遺伝子転写産物の増幅が必要です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAを増幅するための一般的な方法です。RNAベースのPCRでは、まずRNAサンプルを逆転写酵素で相補的DNA（cDNA）に逆転写します。
少量のDNAを増幅するために、DNAテンプレート、少なくとも1組の特異的プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、適切な緩衝液、および耐熱性DNAポリメラーゼを用いた従来のPCRと同じ方法論が用いられます。蛍光色素で標識された物質が、必要な波長で励起された後の蛍光色素の蛍光を測定するセンサーを備えたサーマルサイクラー内のこの混合物に添加され、1つまたは複数の特定の産物の生成速度を測定できるようになります。これにより、各PCRサイクルで増幅産物の生成速度を測定できます。このようにして生成されたデータは、コンピュータソフトウェアで解析して、複数のサンプルにおける相対的な遺伝子発現（またはmRNAコピー数）を計算できます。定量PCRは、サンプル中のDNAの検出と定量にも適用でき、これらのサンプル中の特定のDNA配列の存在と量を決定します。[ 2 ]この測定は各増幅サイクル後に行われるため、この方法はリアルタイムPCR（つまり、即時または同時PCR）と呼ばれます。
定量PCRとDNAマイクロアレイは、遺伝子発現を研究するための最新の手法です。mRNA量を測定するために、以前はディファレンシャルディスプレイ、RNase保護アッセイ、ノーザンブロットなどの古い方法が使用されていました。ノーザンブロッティングは、サンプル中のmRNA転写産物の量を可視化することで、遺伝子の発現レベルを推定するためによく使用されます。この方法では、精製されたRNAをアガロースゲル電気泳動で分離し、固体マトリックス（ナイロン膜など）に転写し、目的の遺伝子に相補的な特定のDNAまたはRNAプローブでプローブします。この技術は遺伝子発現を評価するために今でも使用されていますが、比較的多くのRNAが必要であり、mRNAレベルの定性的または半定量的な情報しか得られません。[ 3 ]定量方法の変動から生じる推定誤差は、DNAの完全性、酵素効率、および他の多くの要因の結果である可能性があります。このため、多くの標準化システム（多くの場合、正規化方法と呼ばれます）が開発されています。遺伝子発現全体を定量化するために開発されたものもありますが、最も一般的なものは、ほぼ一定の発現レベルを持つノーマライザイジング遺伝子と呼ばれる別の遺伝子との関連で、研究対象の特定の遺伝子を定量化することを目的としています。これらの遺伝子は、基本的な細胞生存に関連する機能を持つため、通常は構成的遺伝子発現を伴うハウスキーピング遺伝子から選択されることがよくあります。[ 4 ] [ 5 ]これにより、研究者は、関心のある遺伝子の発現を選択したノーマライザーの発現で割った比率を報告することができ、実際の発現レベルを知らなくても前者を比較することができます。
最も一般的に使用されるノーマライゼーション遺伝子は、チューブリン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、アルブミン、シクロフィリン、およびリボソームRNAをコードする遺伝子です。[ 3 ]
リアルタイムPCRは、各サンプルに少なくとも1つの特定の波長の光を照射し、励起された蛍光色素から放出される蛍光を検出できるサーマルサイクラーを用いて行われます。サーマルサイクラーはサンプルを急速に加熱および冷却することも可能であり、それによって核酸とDNAポリメラーゼの物理化学的特性を有効活用します。
PCRプロセスは一般的に、25～50回繰り返される一連の温度変化から構成されます。これらのサイクルは通常3つの段階から構成されます。最初の段階は、約95 ℃で核酸の二重鎖を分離します。2番目の段階は、約50～60 ℃でプライマーとDNAテンプレートを結合させます。[ 6 ] 3番目の段階は、68～72 ℃でDNAポリメラーゼによる重合を促進します。断片のサイズが小さいため、このタイプのPCRでは通常最後のステップは省略されます。これは、酵素がアライメント段階と変性段階の間の変化中にDNA増幅産物を複製できるためです。さらに、4段階PCRでは、 非特異的な色素を使用した場合にプライマーダイマーの存在によって引き起こされるシグナルを低減するために、各サイクルで数秒間だけ続く短い温度段階（例えば80℃）で蛍光を測定します。[ 7 ]各サイクルで使用される温度とタイミングは、DNA合成に使用される酵素、反応中の二価イオンとデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）の濃度、プライマーの結合温度など、さまざまなパラメーターに依存します。[ 8 ]
リアルタイムPCR法は、PCR産物を検出するために使用される化学的手法、すなわち特異的または非特異的な蛍光色素によって分類することができる。
DNA結合色素はPCR中のすべての二本鎖（ds）DNAに結合し、色素の蛍光量子収率を高めます。したがって、PCR中にDNA産物が増加すると、各サイクルで測定される蛍光強度も増加します。しかし、SYBR GreenなどのdsDNA色素は、非特異的なPCR産物（プライマーダイマーなど）を含むすべてのdsDNA PCR産物に結合します。これは、目的の標的配列の正確なモニタリングを妨げたり、阻害したりする可能性があります。
dsDNA色素を用いたリアルタイムPCRでは、通常の反応液に蛍光dsDNA色素を添加して反応液を調製します。その後、リアルタイムPCR装置で反応を行い、各サイクル後に検出器で蛍光強度を測定します。この色素はdsDNA（すなわちPCR産物）に結合した場合にのみ蛍光を発します。この方法の利点は、増幅に必要なプライマーが1組だけで済むためコストを抑えられることです。また、異なる種類の色素を用いることで、1本のチューブ内で複数の標的配列をモニタリングすることも可能です。
蛍光レポータープローブは、プローブに相補的な配列を含むDNAのみを検出するため、レポータープローブを使用することで特異性が大幅に向上し、他の二本鎖DNAが存在する場合でもこの手法を実行できます。異なる色の標識を用いることで、蛍光プローブはマルチプレックスアッセイに使用でき、同一チューブ内で複数の標的配列をモニタリングできます。蛍光レポータープローブの特異性により、PCRにおける望ましくない副産物であるプライマーダイマーによる測定の干渉も防止されます。ただし、蛍光レポータープローブはプライマーダイマーの阻害効果を防ぐことはできず、反応における目的産物の蓄積を抑制する可能性があります。
この方法は、一方の端に蛍光レポーター、もう一方の端に蛍光消光剤が結合したDNAベースのプローブを利用する。レポーターと消光剤が近接しているため、蛍光の検出は妨げられる。Taqポリメラーゼの5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、レポーターと消光剤の近接性が解消され、消光されていない蛍光が放出される。この蛍光はレーザー励起後に検出できる。したがって、各PCRサイクルでレポータープローブが標的とする産物が増加すると、プローブの分解とレポーターの放出により、蛍光強度も比例して増加する。
リアルタイムPCRでは、DNAの融解温度（融解温度の略でTm値とも呼ばれる）の分析によって、増幅された特定のDNA断片を同定することができます。通常、使用される方法は、レポーターとして二本鎖DNA結合色素を用いたPCRであり、使用される色素は通常SYBR Greenです。DNAの融解温度は、増幅された断片に特異的です。この技術の結果は、分析されたDNAサンプルの解離曲線を比較することによって得られます。[ 10 ]
従来のPCRとは異なり、この方法は、すべてのサンプルの結果を示すために電気泳動法を用いる必要がありません。これは、定量PCRは動態解析法であるにもかかわらず、通常は明確な終点で評価されるためです。したがって、この方法は、電気泳動法よりも迅速な結果が得られ、かつ／または使用する反応物が少なくて済みます。その後の電気泳動が必要な場合でも、リアルタイムPCRで疑わしい結果が出たサンプル、および／または特定の決定因子に対して陽性反応を示したサンプルの結果を確認するためにのみ実施すれば十分です。
エンドポイントPCR（従来型PCR）とは異なり、リアルタイムPCRでは、蛍光を測定することにより、増幅プロセスの任意の時点で目的の産物をモニタリングできます（リアルタイムでは、特定の閾値を超えるレベルが測定されます）。リアルタイムPCRによるDNA定量化の一般的な方法は、蛍光を対数スケールでサイクル数に対してプロットすることに基づいています。DNAベースの蛍光を検出するための閾値は、バックグラウンドを超える信号ノイズの標準偏差の3～5倍に設定されます。蛍光が閾値を超えるサイクル数は、閾値サイクル（C t）またはMIQEガイドラインに従って定量サイクル（C q）と呼ばれます。[ 1 ]この方法を使用すると、開始mRNAの量が多いほど、C qは低くなります。
指数関数的増幅段階では、標的DNAテンプレート（アンプリコン）の量はサイクルごとに倍増します。たとえば、C qが別のサンプルより3サイクル先行するDNAサンプルには、2 3 = 8倍のテンプレートが含まれています。ただし、増幅効率はプライマーとテンプレートによって変動することがよくあります。そのため、プライマーとテンプレートの組み合わせの効率は、 DNAテンプレートの連続希釈を用いた滴定実験で評価され、各希釈における(C q )の変化の標準曲線が作成されます。次に、線形回帰の傾きを使用して増幅効率を決定します。1:2の希釈で(C q )の差が1になる場合は、増幅効率は100%です。サイクル閾値法は、反応機構についていくつかの仮定を置いており、データ解析中に大きなばらつきを引き起こす可能性のある、増幅プロファイルの低信号対雑音比領域からのデータに依存しています。[ 11 ]
遺伝子発現を定量化するために、目的遺伝子のRNAまたはDNAの(Cq )を、同じサンプル内のハウスキーピング遺伝子のRNA/DNAの(Cq )から差し引いて、異なるサンプル間のRNAの量と質の変動を正規化します。この正規化手順は一般にΔCt法[ 12 ]と呼ばれ、異なるサンプル間で目的遺伝子の発現を比較できます。ただし、このような比較を行うには、正規化参照遺伝子の発現がすべてのサンプルで非常に類似している必要があります。したがって、この基準を満たす参照遺伝子を選択することは非常に重要であり、さまざまな条件や組織で同等の発現レベルを示す遺伝子はごくわずかであるため、しばしば困難です。[ 13 ] [ 14 ]サイクル閾値分析は多くの市販ソフトウェアシステムに統合されていますが、再現性が懸念される場合は、増幅プロファイルデータを分析するためのより正確で信頼性の高い方法を検討する必要があります。[ 11 ]
メカニズムに基づくqPCR定量法も提案されており、定量に標準曲線が不要であるという利点があります。MAK2 [ 15 ]などの方法は、標準曲線法と同等またはそれ以上の定量性能を示すことが示されています。これらのメカニズムに基づく方法は、ポリメラーゼ増幅プロセスに関する知識を使用して、元のサンプル濃度の推定値を生成します。このアプローチの拡張には、PCR反応プロファイル全体の正確なモデルが含まれており、これにより、高信号対雑音比のデータの使用と、分析前にデータ品質を検証する機能が可能になります。[ 11 ]
Ruijterらの研究[ 16 ]によると、MAK2はPCR反応中の増幅効率が一定であると仮定している。しかし、MAK2の由来となったポリメラーゼ連鎖反応の理論的解析では、PCR全体を通して増幅効率が一定ではないことが明らかになっている。MAK2による定量は、通常のqPCR条件下ではサンプル中の標的DNA濃度の信頼できる推定値を提供するが、MAK2は競合測定器を用いたqPCRアッセイの標的濃度を信頼できる形で定量することはできない。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）は、実験室において数多くの用途があります。診断研究と基礎研究の両方で広く用いられています。産業界におけるこの技術の用途としては、食品や植物性物質中の微生物量の定量、遺伝子組み換え生物（GMO ）の検出、ヒトウイルス病原体の定量および遺伝子型判定などが挙げられます。
従来のDNA検出法による遺伝子発現の定量は信頼性が低い。ノーザンブロットでのmRNAの検出やゲルまたはサザンブロットでのPCR産物の検出では、正確な定量はできない。[ 17 ]例えば、典型的なPCRの20～40サイクルでは、DNA産物の量はプラトーに達するが、これは最初のPCRにおける標的DNAの量と直接相関しない。[ 18 ]
リアルタイムPCRは、相対定量と絶対定量という2つの一般的な方法で核酸を定量するために使用できます。 [ 19 ]絶対定量では、検量線を使用してDNA標準と比較することにより、標的DNA分子の正確な数が得られます。したがって、サンプルと標準のPCRの増幅効率が同じであることが不可欠です。[ 20 ] 相対定量は、内部参照遺伝子に基づいて、標的遺伝子の発現の倍率差を決定します。定量は、相補的DNA （mRNAの逆転写によって生成されるcDNA ）として解釈されるmRNAの発現レベルの変化として表されます。相対定量は、研究対象の遺伝子の量をコントロール参照遺伝子の量と比較するため、検量線を必要としないため、実行が容易です。
相対定量の結果を表すのに使用される単位は重要ではないため、結果はさまざまな RTqPCR 間で比較できます。 1 つ以上のハウスキーピング遺伝子を使用する理由は、逆転写の効率、ひいては PCR プロセス全体の効率に影響を与える可能性のある、使用する RNA の量と質の差などの非特異的変動を補正するためです。 ただし、このプロセスの最も重要な側面は、参照遺伝子が安定している必要があることです。[ 21 ]
これらの参照遺伝子の選択は、従来、分子生物学において、RNAゲルの目視検査、ノーザンブロットデンシトメトリー、半定量PCR（PCR模倣）などの定性的または半定量的研究を用いて行われてきた。現在、ゲノム時代においては、トランスクリプトミクス技術を用いて多くの生物についてより詳細な推定を行うことができる。[ 22 ]しかし、研究により、mRNAの発現を定量化するために使用される参照遺伝子の大部分の増幅は、実験条件によって変動することが示されている。[ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]したがって、最も適切な参照遺伝子を選択するために、統計的に妥当な方法論的研究を最初に行う必要がある。
特定の条件下でどの遺伝子が最も適しているかを検出できる統計アルゴリズムが数多く開発されています。geNORMやBestKeeperのようなアルゴリズムは、異なる参照遺伝子と組織のマトリックスについて、ペアまたは幾何平均を比較できます。[ 3 ] [ 5 ]適切なエラー伝播を伴うqPCR解析ワークフロー全体がGenExに実装されています。
診断用定性PCRは、例えば感染症[ 26 ] [ 27 ]、癌、遺伝子異常などの診断に用いられる核酸を迅速に検出するために用いられる。臨床微生物検査室への定性PCRアッセイの導入により、感染症の診断が大幅に改善され[ 28 ] 、インフルエンザやコロナウイルスの新株などの新興感染症を検出するためのツールとして診断検査に用いられている[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]。
定量PCRは、食品安全、食品腐敗、発酵の分野で働く微生物学者や、水質（飲料水およびレクリエーション用水）の微生物リスク評価、公衆衛生保護にも使用されています。[ 32 ]
qPCRは、環境サンプルから採取したDNA中の遺伝子の分類学的または機能的マーカーを増幅するためにも使用できます。[ 33 ]マーカーは、DNAの遺伝子断片または相補的DNAによって表されます。[ 33 ]特定の遺伝要素を増幅することにより、増幅前にサンプル中の要素の量を定量化できます。[ 33 ]分類学的マーカー（リボソーム遺伝子）とqPCRを使用すると、サンプル中の微生物の量を決定するのに役立ち、マーカーの特異性に基づいて異なる科、属、または種を識別できます。[ 33 ]機能的マーカー（タンパク質コード遺伝子）を使用すると、コミュニティ内の遺伝子発現を示すことができ、環境に関する情報が明らかになる可能性があります。[ 33 ]
農業業界は、経済的損失を防ぎ、健康を守るために、病原菌のない植物繁殖体や苗を生産しようと常に努力している。オークなどの樹種を枯死させる卵菌であるPhytophthora ramorumのDNAが宿主植物のDNAに混入している場合、その微量なDNAを検出できるシステムが開発されている。病原体と植物のDNAの識別は、各分類群に特徴的なリボソームRNA遺伝子のコード領域にあるスペーサーであるITS配列の増幅に基づいている。[ 34 ]この技術の現場版も、同じ病原体を識別するために開発されている。[ 35 ]
逆転写を用いたqPCR（RT-qPCR）は、DNA検出における感度とダイナミックレンジの高さから、GMOの検出に使用できます。DNAやタンパク質分析などの代替法は、通常、感度が低くなります。トランスジーンではなく、プロモーター、ターミネーター、あるいはベクターのエンジニアリング過程で使用される中間配列を増幅する特異的プライマーが使用されます。トランスジェニック植物の作成過程では通常、トランスジーンの複数のコピーが挿入されるため、その量も一般的に評価されます。これは多くの場合、処理された種から単一コピーとしてのみ存在するコントロール遺伝子を使用して相対定量化によって行われます。[ 36 ] [ 37 ]
ウイルスは、直接感染または同時感染によりヒトに存在することがあり、従来の技術では診断が困難で、誤った予後や治療につながる可能性があります。qPCR を使用すると、 B 型肝炎ウイルスなどのウイルスの定量と遺伝子型判定 (融解曲線を使用して行われる株の特性評価) の両方が可能になります。[ 38 ]患者の組織単位あたりのウイルスゲノムのコピーとして定量化される感染の程度は、多くの場合重要です。たとえば、1 型単純ヘルペスウイルスが再活性化する確率は、神経節内の感染ニューロンの数に関連しています。[ 39 ]この定量化は、逆転写ありまたはなしで行われます。ウイルスがサイクルのどの時点でもヒトゲノムに組み込まれる場合、たとえばHPV (ヒトパピローマウイルス) の場合のように、一部の変異株が子宮頸がんの発生に関連している場合などです。[ 40 ] リアルタイムPCRは、固形臓器移植または骨髄移植後に免疫抑制状態にある患者に見られるヒトサイトメガロウイルス（CMV）の定量化ももたらした。 [ 41 ]
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