単一細胞トランスクリプトミクス

単一細胞トランスクリプトミクスは、数百から数千の遺伝子のRNA濃度（従来はメッセンジャーRNA （mRNA）のみ）を同時に測定することにより、特定の集団内の個々の細胞の遺伝子発現レベルを調べます。 ^{[1]単一細胞トランスクリプトミクスにより、これまでバルクRNAシーケンシングでは隠されていた、}異種細胞集団の解明、細胞発達経路の再構築、転写ダイナミクスのモデル化が可能になります。 ^[2]

ハイスループットRNAシーケンシング（RNA-seq）とマイクロアレイの開発により、遺伝子発現解析が日常的に行われるようになりました。RNA解析はこれまで、ノーザンブロット法や定量PCR法による個々の転写産物の追跡に限られていました。スループットと速度の向上により、研究者は数千の細胞集団の発現プロファイルを頻繁に特徴付けることができます。バルクアッセイから得られるデータは、異なる細胞集団で発現が異なる遺伝子の特定やバイオマーカーの発見につながっています。^[3]

これらの研究は、組織全体の測定値を提供するため、結果としてすべての構成細胞の平均発現プロファイルを示すという限界があります。これにはいくつかの欠点があります。まず、同じ組織内の異なる細胞タイプは、多細胞生物で異なる役割を果たすことがあります。それらはしばしば、独自の転写プロファイルを持つサブポピュレーションを形成します。サブポピュレーションの遺伝子発現の相関は、サブポピュレーションの識別がないため、見逃されることがよくあります。^[1]次に、バルクアッセイでは、発現プロファイルの変化が調節の変化によるものか構成の変化によるものかを認識することができません。たとえば、1 つの細胞タイプが出現して集団を支配するようになった場合などです。最後に、分化による細胞の進行を研究することが目的である場合、平均発現プロファイルでは、細胞を発達段階ではなく時間でしか順序付けできません。したがって、特定の段階に固有の遺伝子発現レベルの傾向を示すことはできません。^[4]

バイオテクノロジーの最近の進歩により、数百から数千の個々の細胞における遺伝子発現を同時に測定することが可能になりました。トランスクリプトミクス技術のこれらのブレークスルーにより、単一細胞トランスクリプトミクスデータの生成が可能になりましたが、同時に新しい計算および分析上の課題も提示されました。バイオインフォマティクスの専門家は、単一細胞データにバルクRNA-seqの技術を使用できます。それでも、単一細胞発現プロファイルの完全かつ詳細な研究を容易にするために、このデータタイプ用に多くの新しい計算手法を設計する必要がありました。^[5]

これまでのところ、単一細胞データを生成するための標準化された技術は存在せず、すべての方法には、集団からの細胞分離、溶解物の形成、逆転写による増幅 、発現レベルの定量化が含まれる必要があります。発現を測定するための一般的な技術は、定量PCRまたはRNA-seqです。^[6]

単一細胞分析のために細胞を分離して増幅する方法はいくつかあります。低スループット技術では、数百の細胞を分離でき、処理速度は遅く、選択が可能です。これらの方法には次のものがあります。

• マイクロピペッティング
• 細胞質吸引
• レーザーキャプチャーマイクロダイセクション。

ハイスループット法では、数百から数万の細胞を迅速に分離することができます。^[7]一般的な技術には以下のものがあります。

• 蛍光活性化細胞選別（FACS）
• マイクロ流体デバイス

FACSとscRNA-seqを組み合わせることで、SORT-seqなどの最適化されたプロトコルが生まれました。^[8] SORT-seqを利用した研究のリストはここで見ることができます。^[9]さらに、マイクロ流体デバイスとscRNA-seqの組み合わせは、10x Genomicsプロトコルで最適化されています。^[10]

各転写産物の発現レベルを測定するために、qPCR を適用することができます。通常のPCRと同様に、遺伝子特異的プライマーを使用して対応する遺伝子を増幅するため、通常、100 個未満の遺伝子のサンプル サイズのデータ​​のみが得られます。ハウスキーピング遺伝子を含めることで、その条件下で発現が一定になるはずであり、正規化に使用されます。最も一般的に使用されるハウスキーピング遺伝子にはGAPDHと α-アクチンがありますが、このプロセスによる正規化の信頼性は、発現レベルが大幅に変化する可能性があるという証拠があるため疑問視されています。^[11]蛍光色素は、 PCR 産物を検出し、増幅の進行を監視するためのレポーター分子として使用されます。蛍光強度の増加は、アンプリコン濃度に比例します。蛍光とサイクル数のプロットを作成し、しきい値蛍光レベルを使用して、プロットがこの値に達するサイクル数を見つけます。この時点でのサイクル数はしきい値サイクル (C _t ) と呼ばれ、各遺伝子について測定されます。^[12]

シングルセル RNA-seq技術は、RNAの集団をcDNA断片のライブラリに変換します。これらの断片は、高スループットの次世代シーケンシング技術によって配列決定され、読み取りは参照ゲノムにマッピングされ、各遺伝子に関連付けられた読み取りの数をカウントします。^[13]

RNA-seqデータの正規化は、cDNAライブラリの形成と配列決定の効率における細胞間のばらつきを考慮します。1つの方法は、各細胞溶解物に等量添加された外因性RNAスパイクイン（配列と量が既知のRNA配列）を使用し、スパイクインmRNAにマッピングされたリード数でリード数を正規化します。^[14]

もう一つのコントロールは、増幅前に各cDNAに追加され、各cDNA分子のバーコードとして機能する、6～10ntの短いDNA配列であるユニーク分子識別子（UMI）を使用する。増幅効率の違いを考慮するために、各遺伝子に関連付けられたユニークUMIの数を使用して正規化が達成される。^[15]

より正確な正規化を実現するために、スパイクイン、UMI、およびその他のアプローチの両方が組み合わされています。

単一細胞データに関連する問題は、テクニカルドロップアウトと呼ばれる遺伝子発現分布のゼロ膨張の形で発生します。これは、逆転写プロセスで捕捉されない発現の少ない遺伝子のmRNA濃度が低いためによく発生します。検出される細胞溶解物中のmRNA分子の割合は、多くの場合10〜20％にすぎません。^[16]

RNAスパイクインを正規化に使用する場合、内因性RNAとスパイクインRNAの増幅効率とシーケンシング効率は同じであると仮定されます。スパイクインにはポリアデニル化テールがないため長さが短いなど、サイズと特徴に根本的な違いがあるため、これは当てはまらないという証拠があります。 ^[17]さらに、UMIを使用した正規化では、cDNAライブラリが飽和状態までシーケンシングされていると仮定しますが、必ずしもそうとは限りません。^[15]

単一細胞データ分析に基づく洞察では、入力は上記のアプローチによって生成された正規化された遺伝子発現カウントのマトリックスであると想定されており、一括では得られない機会を提供できます。

3つの主な洞察が示された：^[18]

1. 細胞タイプの識別と特徴付け、および時間におけるそれらの空間的構成
2. 遺伝子制御ネットワークとその強度を個々の細胞にわたって推定する
3. 転写の確率的要素の分類

概説した手法は、これら 3 つの特徴を明らかにしやすくするために、データ内のパターンを視覚化して探索できるように設計されています。

クラスタリングにより、細胞集団のサブグループを形成できます。細胞はトランスクリプトームプロファイルによってクラスタリングされ、サブ集団構造を分析し、希少な細胞タイプまたは細胞サブタイプを識別できます。あるいは、遺伝子は発現状態によってクラスタリングされ、共変遺伝子を識別できます。両方のクラスタリング手法を組み合わせたバイクラスタリングは、遺伝子と細胞を同時にクラスタリングして、細胞クラスター内で同様に動作する遺伝子を見つけるために使用されています。^[19]

適用されるクラスタリング手法には、分離したグループを形成するK 平均法クラスタリング、またはネストされたパーティションを形成する階層的クラスタリングがあります。

バイクラスタリングは、クラスタリングの解像度を向上させることでいくつかの利点を提供します。バイクラスタリングにより、細胞のサブセットにのみ情報を与え、そのサブセットでのみ発現する遺伝子を特定できます。さらに、この方法を使用すると、1つの細胞クラスターを別の細胞クラスターと区別する同様の動作をする遺伝子を特定できます。^[20]

主成分分析（PCA）やt-SNEなどの次元削減アルゴリズムは、高次元空間のセルを低次元空間に変換することで、視覚化やパターン検出のためにデータを簡素化するために使用できます。この方法の結果、各セルを2次元または3次元空間の点としてグラフが生成されます。高次元のセルは距離測定が直感的でない動作をするため、誤って近くにあるように見える可能性があるため、次元削減はクラスタリングの前によく使用されます。^[21]

最も頻繁に使用される手法はPCAであり、これは最大分散の 主成分の方向を識別し、最初の主成分が可能な限り最大の分散を持ち、後続の主成分がそれぞれ前の成分と直交したまま可能な限り最大の分散を持つようにデータを変換します。各遺伝子が各成分に与える寄与は、どの遺伝子が集団の分散に最も寄与し、異なるサブ集団の差別化に関与しているかを推測するために使用されます。^[22]

2つの集団間の遺伝子発現レベルの違いを検出するには、単一細胞データとバルクトランスクリプトームデータの両方が使用されます。単一細胞データ用に、技術的なドロップアウトや分布の形状（例：バイモーダル対ユニモーダル）などの単一細胞の特徴を考慮した特殊な方法が設計されています。^[23]

遺伝子オントロジーの用語は、遺伝子の機能とそれらの機能間の関係を 3 つのクラスで説明します。

1. 分子機能
2. 細胞成分
3. 生物学的プロセス

遺伝子オントロジー（GO）用語エンリッチメントは、特定の遺伝子セットでどのGO用語が過剰に表現されているか、または過小に表現されているかを識別するために使用される技術です。単一細胞解析では、バイクラスタリングから生成された差次的に発現する遺伝子または遺伝子グループに基づいて、関心のある遺伝子の入力リストを選択できます。入力リストでGO用語に注釈が付けられた遺伝子の数は、ゲノム内のすべての遺伝子の背景セットでGO用語に注釈が付けられた遺伝子の数に対して正規化され、統計的有意性が決定されます。^[24]

疑似時間的順序付け (または軌跡推論) は、スナップショットの単一細胞データから遺伝子発現ダイナミクスを推測することを目的とした手法です。この方法では、類似の細胞が互いに近接するように細胞を順序付けようとします。この細胞の軌跡は直線になることもありますが、分岐したり、より複雑なグラフ構造をたどることもあります。したがって、この軌跡により、遺伝子発現ダイナミクスを推測し、分化の進行や外部刺激への応答による細胞の順序付けが可能になります。この方法は、細胞が対象のプロセスを通じて同じパスをたどり、その転写状態が進行と相関するという仮定に基づいています。このアルゴリズムは、混合集団と時間サンプルの両方に適用できます。

疑似時間的順序付けには 50 種類以上の方法が開発されており、それぞれに事前情報 (開始セルや時間経過データなど)、検出可能なトポロジー、方法論に関する独自の要件があります。^{[25]アルゴリズム}の例としては、データの次元削減を実行し、変換されたデータを使用して最小全域木を構築し、ツリーの最長接続パスをたどって疑似時間でセルを順序付け、その結果セルにタイプ別のラベルを付ける Monocle アルゴリズム [26] があります。別の例としては、拡散疑似時間 (DPT) アルゴリズム^[24]があり、これは拡散マップと拡散プロセスを使用します。MARGARET ^[27]などの別のクラスの方法では、切断された軌道や多分岐軌道などの複雑な軌道トポロジーをキャプチャするためにグラフ分割を使用します。

遺伝子調節ネットワーク推論は、ノードが遺伝子を表し、エッジが共調節相互作用を示すグラフとして表示されるネットワークを構築することを目的とした手法です。この方法は、遺伝子の発現間の強い統計的関係は潜在的な機能的関係の兆候であるという仮定に基づいています。 ^[28]統計的関係の強さを測定するために最も一般的に使用される方法は相関です。ただし、相関では非線形関係を識別できないため、代わりに相互情報量が使用されます。ネットワークでリンクされた遺伝子クラスターは、発現が協調的に変化する遺伝子を意味します。^[29]

異なる実験プロトコルを使用して異なる条件下で生成された単一細胞トランスクリプトミクスデータセットでは、技術的効果の有無や強さ、観察される細胞の種類がしばしば異なります。この違いにより強いバッチ効果が生じ、特に交絡因子がある場合には、バッチ全体に適用された統計的手法の結果にバイアスがかかる可能性があります。^[30] 単一細胞トランスクリプトミクスデータの前述の特性の結果、バルクシーケンスデータ用に開発されたバッチ補正法は、パフォーマンスが低いことが観察されました。その結果、研究者は、単一細胞トランスクリプトミクスデータの特性に対して堅牢なバッチ効果を補正し、異なるソースまたは実験バッチからのデータを統合する統計的手法を開発しました。Laleh Haghverdiは、各バッチ間の相互最近傍を使用してバッチ補正ベクトルを定義する基礎研究を行いました。^{[31]これらのベクトルを使用すると、それぞれが少なくとも1つの共有細胞タイプを含むデータセットをマージできます。直交アプローチでは、}正準相関分析を使用して各データセットを共有低次元空間に投影します。^[32]相互最近傍法と正準相関分析を組み合わせて、あるデータセット内の参照細胞を含む統合「アンカー」を定義し、別のデータセット内のクエリ細胞をそのアンカーに正規化することもできます。^[33]別のクラスの方法（例：scDREAMER ^[34]）は、変分オートエンコーダなどの深層生成モデルを使用して、バッチ不変の潜在的な細胞表現を学習します。これは、細胞タイプのクラスタリング、単一細胞遺伝子発現ベクトルのノイズ除去、軌道推定などの下流のタスクに使用できます。^[27]

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