エタノール沈殿

エタノール沈殿法は、塩とエタノールを貧溶媒として加えることで、水溶液からRNA、DNA、およびペクチンやキシログルカンなどの多糖類を精製および/または濃縮する方法です。

DNA 抽出では、水中で DNA を他の細胞成分から分離した後、DNA を正に帯電したイオンで中和して溶液から沈殿させます。溶液にエタノールを加えることで、溶媒の極性を下げ、正に帯電したイオンが DNA の負に帯電したリン酸基と相互作用できるようになります。

DNA は通常、フェノールと水の 2 相溶液で他の細胞成分から分離されます。DNA は高電荷のリン酸骨格を持つため極性があり、水相に集中しますが、脂質とタンパク質はフェノール相に集中します。

DNAを水から沈殿させるには、塩から正に帯電したイオンを加えてDNA骨格の負に帯電したリン酸基を中和します。しかし、水の高極性（誘電率が80.1（20℃））のため、正に帯電したイオンは遮蔽され、DNAの負に帯電したリン酸基と相互作用して中和することができません。^[1]

この関係はクーロンの法則に反映されており、この法則は、媒体の誘電率（相対静電誘電率とも呼ばれる）を方程式の分母（電気定数）に使用することで、距離を置いて離れた2 つの電荷に作用する力を計算するために使用できます。 ${\displaystyle q_{1}}$${\displaystyle q_{2}}$${\displaystyle r}$${\displaystyle \varepsilon _{r}}$${\displaystyle \varepsilon_{0}}$

${\displaystyle F={\frac {1}{4\pi \varepsilon _{r}\varepsilon _{0}}}{\frac {q_{1}q_{2}}{r^{2}}} }$

原子レベルでは、電荷に作用する力の減少は、水分子がその周りに水和殻を形成することによって生じます。この事実により、水は塩などの帯電化合物にとって非常に優れた溶媒となります。

エタノールは水よりも極性が低く、誘電率は 24.3 (25 °C) です。つまり、溶液にエタノールを加えると、水による電荷の遮蔽が妨げられます。十分な量のエタノールを加えると、リン酸基と溶液中に存在する陽イオン間の電気的引力が十分に強くなり、安定したイオン結合が形成されて DNA が溶液から沈殿します。これは通常、エタノールが溶液の 64% 以上を占める場合に発生します。メカニズムが示唆するように、沈殿が発生するには溶液に陽イオンが含まれている必要があり、通常は Na ⁺、NH ₄ ^{+ 、}または Li ^{+ が}この役割を果たします。^[2]

DNA を沈殿させるには、まず溶液中に適切な濃度の陽イオンが存在することを確認し（濃度が高すぎると多くの塩が DNA と共沈殿し、低すぎると DNA の回収が不完全になります）、次に 2 ～ 3 倍量の 95% 以上のエタノールを加えます。多くのプロトコルではこの時点で DNA を低温で保管することを推奨していますが、一晩インキュベーションしても DNA の回収率は改善されず、沈殿効率が低下する可能性さえあるという観察結果もあります。^{[3] [4]}そのため、室温でも良好な効率が得られますが、劣化の可能性を考慮すると、DNA を湿った氷上でインキュベートする方がよいでしょう。最適なインキュベーション時間は DNA の長さと濃度によって異なります。断片が小さく濃度が低い場合は、許容できる回収率を得るのに長い時間が必要です。長さが非常に短く濃度が低い場合は、一晩インキュベーションすることをお勧めします。このような場合は、tRNA、グリコーゲン、直鎖ポリアクリルアミドなどのキャリアを使用すると、回収率が大幅に向上します。

インキュベーション中にDNAと一部の塩が溶液から沈殿します。次のステップで、この沈殿物をマイクロ遠心管で高速（約12,000 g ）で遠心分離して集めます。遠心分離の時間と速度は、DNAの回収率に最も大きな影響を及ぼします。また、断片が小さいほど、希釈度が高いほど、より長く速い遠心分離が必要です。遠心分離は、室温、4℃、または0℃のいずれかで行うことができます。遠心分離中、沈殿したDNAはエタノール溶液を通って管の底まで移動する必要があります。温度が低いと溶液の粘度が高くなり、容量が大きいと距離が長くなるため、これらの要因の両方がこのプロセスの効率を低下させ、同じ効果を得るためにはより長い遠心分離が必要になります。^{[3] [4]} 遠心分離後、上清溶液が除去され、粗DNAのペレットが残ります。ペレットが見えるかどうかは、DNA の量と純度 (汚れたペレットの方が見やすくなります)、または共沈殿剤の使用によって決まります。

次のステップでは、70% エタノールをペレットに加え、軽く混ぜてペレットをほぐし、洗浄します。これにより、残った上清に存在し、DNA ペレットに結合している塩の一部が除去され、最終的な DNA クリーナーが作成されます。この懸濁液を再度遠心分離して、再度 DNA をペレット化し、上清溶液を除去します。このステップを 1 回繰り返します。

最後に、ペレットを空気乾燥させ、DNAを水または他の必要な緩衝液に再懸濁します。ペレットを過度に乾燥させるとDNAが変性し、再懸濁が困難 になる可能性があるため、ペレットを過度に乾燥させないことが重要です。

イソプロパノールもエタノールの代わりに使用できます。イソプロパノールの沈殿効率はエタノールよりも高いため、沈殿には1容量で十分です。ただし、イソプロパノールはエタノールよりも揮発性が低く、最終段階で空気乾燥に時間がかかります。また、イソプロパノールを使用すると、ペレットがチューブにあまり密着しない可能性があります。^[2]

• DNA抽出
• フェノールクロロホルム抽出
• 塩漬け
• 塩析
• SCODA DNA精製
• スピンカラムによる核酸精製

• bitesizebio.com 基礎: DNA と RNA のエタノール沈殿の仕組み
• Zeugin JA, Hartley JL (1985). 「DNAのエタノール沈殿」(PDF) . Focus . 7 (4): 1–2 . 2008-09-10に閲覧。
• Crouse J、Amorese D (1987)。「エタノール沈殿：酢酸ナトリウムの代替としての酢酸アンモニウム」（PDF）。Focus。9 （ 2）：3–5。2009年11月22日にオリジナル（PDF）からアーカイブ。 2008年9月10日に取得。