固定（組織学）

熱固定は、単細胞生物、最も一般的には細菌と古細菌の固定に使用されます。生物は通常、水または生理食塩水と混合され、サンプルを均一に広げるのに役立ちます。希釈されたサンプルは、顕微鏡スライドに塗布されます。この希釈された細菌サンプルは、スライドに塗布された後、一般的に塗抹標本と呼ばれます。塗抹標本が室温で乾燥した後、スライドをトングまたは洗濯ばさみでつかみ、ブンゼンバーナーの炎に数回通して、生物を加熱殺菌し、スライドに接着させます。マイクロ焼却装置を使用することもできます。加熱後、サンプルは通常染色され、顕微鏡を使用して画像化されます。^{[ 4 ]}熱固定は一般的に全体的な形態を保持しますが、内部構造は保持しません。熱はタンパク質分解酵素を変性させ、自己分解を防ぎます。熱固定はカプセル染色法には使用できません。熱固定はカプセル（グリコカリックス）を収縮または破壊し、染色で見ることができなくなるためです。^{[ 5 ]}

浸漬法は、単一細胞から生物全体に至るまで、組織学的サンプルを固定するために使用できます。組織サンプルは、一定時間固定液に浸されます。固定液の体積は、組織の体積の少なくとも 10 倍以上でなければなりません。^{[ 6 ]}固定を成功させるには、固定液が組織全体に拡散する必要があるため、組織のサイズと密度、および固定液の種類を考慮する必要があります。これは細胞アプリケーションで一般的な手法ですが、より大きな組織にも使用できます。より大きなサンプルを使用する場合は、固定液がより深い組織に到達するために、より長い時間浸漬する必要があります。^{[ 7 ]}

灌流とは、臓器や生物の血管または自然な経路を通る体液の通過のことです。灌流による組織固定では、固定液は通常、左心室に挿入された針を通して循環系に注入されます。これは超音波ガイド下で行うことも、被験者の胸腔を開くことによって行うこともできます。^{[ 8 ]}固定液は、通常の心拍出量に見合った注入量で心臓に注入されます。固有の循環系を利用して、固定液は全身に分布し、組織は固定されるまで死にません。この方法を使用する場合、固定液と緩衝液の容量の増加を考慮して、循環系のどこかに排出ポートを追加する必要があります。これは通常、右心房で行われます。固定液は、血液がすべて置き換えられるまで循環系に注入されます。灌流を用いる利点は形態が保存されることであるが^{[ 9 ]}、欠点は被験体が死亡することと、大型生物に必要な固定液の量が多く、コストが増加する可能性があることである。研究対象とならない組織に栄養を供給する動脈を圧迫することで、灌流固定に必要な液量を減らすことができる。灌流固定は、げっ歯類の脳、肺、腎臓組織の画像化によく用いられ、ヒトの剖検にも用いられる。^{[ 7 ] [ 10 ]}

架橋固定剤は、組織内のタンパク質間に共有結合を形成することによって作用します。これにより、可溶性タンパク質が細胞骨格に固定され、組織にさらなる剛性が付与されます。胚分化波中の収縮などの一時的なまたは微細な細胞骨格構造の保存は、架橋固定剤の添加前にマイクロ波を用いた前処理によって最もよく達成されます。^{[ 11 ] [ 12 ]}

組織学で最も一般的に使用される固定剤はホルムアルデヒドです。通常、10%中性緩衝ホルマリン（NBF）として使用されます。これは、リン酸緩衝液（pH 7）中に約3.7%～4.0%のホルムアルデヒドを含む溶液です。ホルムアルデヒドは室温で気体であるため、この固定剤を作る際には、ホルムアルデヒドガスを水に溶解したホルマリン（約37% w/v）が使用されます。ホルムアルデヒドは、タンパク質、主に塩基性アミノ酸であるリジンの残基を架橋することで組織を固定します。その効果は過剰な水によって可逆的であり、ホルマリンによる色素沈着を防ぎます。パラホルムアルデヒドも一般的に使用されており、加熱するとホルマリンに解重合するため、効果的な固定剤となります。パラホルムアルデヒドのその他の利点としては、長期保存が可能であることや組織への浸透性が高いことが挙げられます。特に免疫組織化学法に適しています。ホルムアルデヒド蒸気は、細胞塗抹標本の固定剤としても使用できます。

固定によく用いられるアルデヒドの一つにグルタルアルデヒドがあります。これはホルムアルデヒドと同様に作用し、タンパク質のαヘリックスの変形を引き起こします。しかし、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドよりも分子が大きいため、膜透過速度が遅くなります。そのため、厚い組織サンプルへのグルタルアルデヒド固定は困難な場合があります。この問題は、組織サンプルのサイズを小さくすることで解決できます。グルタルアルデヒド固定の利点の一つは、より強固でしっかりと結合した固定物が得られる可能性があることです。グルタルアルデヒドは分子が長く、アルデヒド基が2つあるため、離れたタンパク質分子同士を「橋渡し」して結合させることができます。グルタルアルデヒドは迅速かつ不可逆的な変化を引き起こし、電子顕微鏡観察に適しており、4  ℃でも良好に機能し、細胞質と核の全体像を最も鮮明に観察できます。ただし、免疫組織化学染色には適していません。

固定方法によっては、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを組み合わせて使用​​し、それぞれの強みを補完し合うようにするものもある。

これらの架橋固定剤、特にホルムアルデヒドは、タンパク質の二次構造を保存する傾向があり、三次構造の大部分も保存する可能性があります。

沈殿性（または変性性）固定剤は、タンパク質分子の溶解度を低下させることによって作用し、多くの場合、多くのタンパク質に三次構造を与える疎水性相互作用を破壊することによって作用します。タンパク質の沈殿と凝集は、アルデヒド系固定剤で起こる架橋とは全く異なるプロセスです。

最も一般的な沈殿固定剤はエタノールとメタノールです。これらは凍結切片や塗抹標本の固定によく用いられます。アセトンも使用されており、アセトン・メチルベンゾエート・キシレン（AMEX）法で用いると、凍結切片よりも優れた組織学的保存性が得られることが示されています。

タンパク質を変性させるメタノール、エタノール、アセトンは、核酸の研究以外では、固定ブロックの固定に単独で使用されることはほとんどない。

酢酸は変性剤であり、DavidsonのAFAなどの他の沈殿固定剤と組み合わせて使用​​されることがあります。^{[ 13 ]}アルコール類は単独では固定中に組織のかなりの収縮と硬化を引き起こすことが知られており、酢酸単独では組織の膨張に関連しています。この2つを組み合わせると、組織形態の保存がより良くなる可能性があります。

酸化固定剤は、タンパク質やその他の生体分子の側鎖と反応し、組織構造を安定化させる架橋を形成する。しかし、微細な細胞構造は維持されるものの、広範な変性を引き起こすため、主に二次固定剤として用いられる。

四酸化オスミウムは、電子顕微鏡用の試料を調製する際の二次固定剤としてよく用いられる。（厚い組織切片への浸透性が非常に低いため、光学顕微鏡用には使用されない。）

二クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウムは、いずれも特定の組織学的標本作製に用いられる。

B-5やゼンカー固定液などの水銀系固定液は、染色強度を高め、核の細部を鮮明に写し出すという未知のメカニズムを持っています。速乾性がある一方で、組織への浸透性は低く、組織の収縮を引き起こします。造血組織や細網内皮組織の固定に最適です。また、水銀を含むため、廃棄には十分な注意が必要です。

ピクリン酸塩は組織によく浸透し、ヒストンや塩基性タンパク質と反応してアミノ酸と結晶性ピクリン酸塩を形成し、すべてのタンパク質を沈殿させます。結合組織の固定剤として優れており、グリコーゲンを良好に保存し、脂質を抽出することで、生体ホルモンやポリペプチドホルモンの免疫染色においてホルムアルデヒドよりも優れた結果をもたらします。ただし、固定後に検体を十分に洗浄しないと、好塩基球が失われるという欠点があります。

Hepes-グルタミン酸緩衝液による有機溶媒保護効果（HOPE）は、ホルマリン様の形態、免疫組織化学および酵素組織化学のためのタンパク質抗原の優れた保存、良好なRNAおよびDNA収量、および架橋タンパク質の不在をもたらします。