ライゲーション（分子生物学）

ライゲーションとは、リガーゼと呼ばれる酵素の作用によって、2つのヌクレオチドまたは2つの核酸断片を1つのポリマー鎖に結合することである。この反応では、1つのヌクレオチドの3'-ヒドロキシル末端と別のヌクレオチドの5'-ホスホリル末端の間にホスホジエステル結合が形成され、その結果、2つのヌクレオチドが1本の鎖上で連続して結合する。ライゲーションは、DNAとRNAの両方で基本的に同じように機能する。反応には一般に補因子が関与し、通常はATPまたはNAD ⁺である。真核生物のリガーゼはATP型に属し、NAD +型は細菌（大腸菌など）に見られる。^[1]

ライゲーションは、DNA複製、転写、スプライシング、組み換えなど、数多くの細胞プロセスの一部として自然に発生し、また、DNA断片を結合して組み換えDNA分子を作成する分子クローニング（外来DNA断片をプラスミドに挿入する場合など）における重要な実験手順でもあります。DNAリガーゼの発見は1967年にさかのぼり、分子生物学の分野における重要な出来事でした。^[1]実験室でのライゲーションは通常、T4 DNAリガーゼを使用して行われます。これは、粘着末端断片だけでなく平滑末端断片も結合できるため、in vitroで広く使用されています。 ^[2]ただし、標準的なDNAリガーゼを使用しないライゲーション手順も一般的です。ヒトDNAリガーゼの異常は、免疫不全、放射線感受性、発達障害を特徴とする病理学的障害に関連しています。^[3]

ライゲーション反応のメカニズムは、I.ロバート・レーマンの研究室で初めて解明されました。^{[4] [5]} 2つのDNA断片は、DNA鎖の一方の端にある3'-ヒドロキシル基（-OH）ともう一方の端にある5'-リン酸基（-PO4）との間のホスホジエステル結合の形成を触媒するDNAリガーゼによって結合される場合があります。動物やバクテリオファージでは、ATPがライゲーションのエネルギー源として使用され、細菌ではNAD ⁺が使用されます。^[6]

DNAリガーゼはまずATPまたはNAD ^{+と反応し、} AMPがリガーゼの活性部位のリジンのεアミノ基にホスホラミド結合を介して結合したリガーゼ-AMP中間体を形成する。次にこのアデニル基はDNA鎖の5'末端のリン酸基に転移し、DNA-アデニル酸複合体を形成する。最後に、DNA鎖の末端の3'-ヒドロキシルが別のDNA鎖の活性化された5'-ホスホリル基に求核攻撃することで、2つのDNA末端の間にホスホジエステル結合が形成される。^[4]

DNAの切れ目（ 二本鎖DNAの一方の鎖の切断）は、リガーゼによって非常に効率的に修復できる。しかし、2つの別々のDNA末端をライゲーションする場合は、ライゲーション反応を進める前に2つの末端を合わせる必要があるため、ライゲーションの複雑な特徴が現れる。粘着末端または凝集末端を持つDNAのライゲーションでは、突出したDNA鎖がすでに一緒にアニールされている可能性があるため、DNAの2つの切れ目を修復することと同等であるため、比較的効率的なプロセスである。しかし、 DNAが一緒にアニールするための突出末端がない平滑末端のライゲーションでは、末端がライゲーションされる前にランダム衝突によって整列することに依存しているため、結果的に効率の悪いプロセスとなる。^[7]大腸菌 由来のDNAリガーゼは、分子が密集している条件以外では平滑末端DNAをライゲーションできないため、通常は実験室でのライゲーションには使用されない。代わりに、一本鎖DNAだけでなく平滑末端DNAも連結できるT4ファージ由来のDNAリガーゼが使用される。 ^{[8] [6]}

酵素媒介化学反応に影響を与える要因は、当然ライゲーション反応にも影響を与えます。これには、酵素と反応物の濃度、反応温度、インキュベーション時間の長さが含まれます。ライゲーションは、反応が分子間反応と分子内反応の両方を伴う可能性があるという事実によって複雑になりますが、多くのライゲーション反応 (DNA フラグメントをベクターにライゲーションするなど) で目的のライゲーション生成物は、まず分子間、つまり 2 つの異なる DNA 分子間で生成する必要があり、その後分子内反応によって分子を密封して環状化する必要があります。効率的なライゲーションには、追加のアニーリング ステップも必要です。

ライゲーション中に新しいホスホジエステル結合を形成する3つのステップは、酵素によるアデニリル化、DNAへのアデニリル基の転移、およびニックシーリングである。Mg(2+)は触媒の補因子であるため、Mg(2+)の濃度が高いとライゲーション効率が高くなります。Mg(2+)の濃度が制限されている場合、ニックシーリングがプロセスの律速反応となり、アデニリル化されたDNA中間体は溶液中に留まります。酵素のこのようなアデニリル化は、LIG1のアキレス腱であるアデニリル化されたDNA中間体との再結合を抑制し、それらが固定されていない場合はリスクを表します。^[9]

DNA の濃度は、ライゲーションの速度、およびライゲーションが分子間反応か分子内反応かに影響する可能性があります。ライゲーションでは、DNA の末端を他の末端と結合しますが、各 DNA フラグメントには 2 つの末端があり、末端が適合している場合、DNA 分子は自身の末端を結合して環状化できます。DNA 濃度が高いと、DNA 分子の一方の末端が別の DNA の末端と出会い、分子間ライゲーションを形成する可能性が高くなります。DNA 濃度が低いと、DNA 分子の一方の末端が同じ分子のもう一方の末端と出会う可能性が高くなるため、 DNA を環状化する分子内反応が発生する可能性が高くなります。線状 DNA の変換効率も環状 DNA よりもはるかに低く、DNA を環状化するには DNA 濃度が高くなりすぎないようにする必要があります。原則として、総 DNA 濃度は 10 μg/ml 未満にする必要があります。^[10]

DNA 断片の相対的な濃度、長さ、緩衝液の条件も、分子間反応と分子内反応のどちらが優先されるかに影響を与える要因となります。

DNA濃度は、コバルトヘキサミンなどの凝縮剤やスペルミジンなどの生体ポリアミンを加えたり、ポリエチレングリコール（PEG）などの混雑剤を使用したりすることで人工的に高めることができ、これらも酵素の有効濃度を高めます。^{[11] [12]}ただし、コバルトヘキサミンなどの添加剤は分子間反応のみを引き起こす可能性があり、^{[11]プラスミドDNAの}形質転換に適した環状DNAではなく線状コンカテマーを生成するため、プラスミドライゲーションには望ましくありません。プラスミドライゲーションに添加剤を使用する必要がある場合は、分子間ライゲーションだけでなく分子内ライゲーションも促進できるため、PEGの使用が望ましいです。^[13]

酵素の場合、リガーゼ濃度が高いほどライゲーション速度が速くなります。平滑末端ライゲーションは粘着末端ライゲーションよりも効率が悪いため、平滑末端ライゲーションではより高濃度のリガーゼが使用されます。高濃度のDNAリガーゼは、より速いライゲーションのためにPEGと組み合わせて使用​​される場合があり、これらは迅速なライゲーション用に設計された市販のキットによく見られる成分です。^{[14] [15]}

ライゲーション反応の温度を考える場合、2 つの問題が関係します。1 つ目は、DNA リガーゼ活性の最適温度である 37 ^° C で、2 つ目は、ライゲーションされる DNA 末端の融解温度(T _m ) です。融解温度は DNA オーバーハングの長さと塩基構成に依存します。G と C の数が多いほど、GC 塩基対間に形成される水素結合が 3 つであるのに対し、AT 塩基対では 2 つであるため、T _mは高くなります。また、断片間の塩基のスタッキングもいくらか影響します。ライゲーション反応を効率的に進めるには、末端が安定してアニールされる必要があり、ライゲーション実験では、 DNA 末端の T m は通常 37 °C よりもはるかに低くなります。_{したがって}^、付着末端をライゲーションするための最適温度は、DNA リガーゼ活性に最適な温度と末端が会合できるT _{mとの間の妥協点となります。} ^[16] しかし、異なる制限酵素は異なる末端を生成し、これらの酵素によって生成される末端の塩基組成も異なる場合があり、融解温度、したがって最適温度は使用する制限酵素によって大きく異なる可能性があり、ライゲーションの最適温度は末端に応じて4〜15℃の間になる可能性があります。^{[ 17] [18]}ライゲーションでは、同じ反応混合物中の異なる制限酵素から生成された末端をライゲーションすることも多いため、特定のライゲーション反応に最適な温度を選択することは実用的ではない可能性があり、ほとんどのプロトコルでは、単に12〜16℃、室温、または4℃を選択します。⁴ ℃^{でライゲーション}を行う場合は、ライゲーション混合物を冷蔵庫に一晩以上放置するなどして、ライゲーション反応の時間を長くする必要があります。

使用される緩衝液のイオン強度はライゲーションに影響を与える可能性があります。存在する陽イオンの種類もライゲーション反応に影響を与える可能性があります。たとえば、Na +の量が多すぎるとDNA^がより硬くなり、分子間ライゲーションの可能性が高まります。一価陽イオンの濃度が高い場合（> 200 mM）、ライゲーションはほぼ完全に阻害されることもあります。^[19]ライゲーションに使用される標準緩衝液は、イオン効果を最小限に抑えるように設計されています。^[20]

制限酵素は、消化した DNA にさまざまな末端を生成できますが、クローニング実験で最も一般的に使用される制限酵素は、粘着末端または付着末端と呼ばれる 4 塩基の一本鎖オーバーハングを生成します (例外として、 2 塩基のオーバーハングを生成するNde Iや、平滑末端を生成する酵素があります)。これらの粘着末端は、他の適合する末端にアニールして、粘着末端 (または付着末端) ライゲーションでライゲーションすることができます。 たとえば、 Eco RI はAATT 末端を生成し、A と T は C と G よりも融点が低いため、その融点 T _{m は約 6} ^° Cと低くなります。 ^[21]ほとんどの制限酵素では、生成されたオーバーハングの T _mは約 15 ^° Cです。 ^[20] 実用上、粘着末端ライゲーションは 12～16 ^° C、または室温で、あるいは 4 ^° C でより長い時間実行されます。

プラスミドベクターに DNA 断片を挿入する場合、2 つの異なる制限酵素を使用して DNA を消化し、異なる末端を生成することが好ましい。2 つの異なる末端により、挿入物のないベクターの再連結を防ぐことができ、また、断片を方向性を持って挿入することも可能になる。

2 つの異なる部位を使用できない場合は、インサートのない再環状ベクター DNA の高いバックグラウンドを回避するために、ベクター DNA を脱リン酸化する必要がある場合があります。末端にリン酸基がないと、ベクターはそれ自体にライゲーションできませんが、リン酸基を持つインサートにライゲーションできます。脱リン酸化は、消化された DNA の 5' 末端からリン酸基を除去する子牛腸アルカリホスファターゼ(CIAP) を使用して一般的に行われますが、CIAP は不活性化が容易ではなく、CIAP を除去する追加手順なしではライゲーションを妨害し、ライゲーションが失敗する可能性があることに注意してください。CIAP は過剰量使用してはならず、必要な場合にのみ使用してください。エビアルカリホスファターゼ(SAP) または南極ホスファターゼ (AP) は簡単に不活性化できるため、適切な代替手段です。

平滑末端ライゲーションでは、突出末端の塩基対形成は行われないため、任意の平滑末端を別の平滑末端にライゲーションすることができます。平滑末端は、SmaI やEco RVなどの制限酵素によって生成できます。平滑末端クローニングの主な利点は、平滑末端は通常PCRで生成されるため、目的の挿入物の配列内に制限部位が不要であり、PCRで生成された平滑末端 DNA フラグメントを、制限消化から生成された平滑末端ベクターにライゲーションできることです。

しかし、平滑末端ライゲーションは粘着末端ライゲーションよりも効率がはるかに低く、通常、反応は粘着末端ライゲーションよりも 100 倍遅くなります。平滑末端には突出末端がないため、ライゲーション反応は平滑末端間のランダムな衝突に依存し、その結果、効率がはるかに低くなります。効率の低さを補うために、使用されるリガーゼの濃度は粘着末端ライゲーションよりも高くなります (10 倍以上)。平滑末端ライゲーションで使用される DNA の濃度も高く、末端間の衝突の可能性が高まり、平滑末端ライゲーションではより長いインキュベーション時間も使用される場合があります。

ベクターにライゲーションする必要がある両端が平滑末端である場合、自己ライゲーションを最小限に抑えるためにベクターを脱リン酸化する必要があります。これはCIAPを使用して行うことができますが、前述のようにその使用には注意が必要です。ベクターは脱リン酸化されており、ライゲーションには5'-リン酸の存在が必要であるため、インサートはリン酸化されなければなりません。平滑末端PCR産物は通常5'-リン酸を欠いているため、T4ポリヌクレオチドキナーゼで処理してリン酸化する必要があります。^[22]

平滑末端ライゲーションも高濃度ATPによって可逆的に阻害される。^[23]

PCR では通常、平滑末端の PCR 産物が生成されますが、Taqポリメラーゼを使用した PCRでは、PCR 産物の 3' 末端に余分なアデニン (A) が追加される可能性があることに注意してください。この特性は、PCR 産物の末端がベクターの T 末端にアニールできる TA クローニングで利用できます。したがって、 TA ライゲーションは粘着末端ライゲーションの一種です。平滑末端ベクターは、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、ジデオキシチミジン三リン酸 (ddTTP) による TA ライゲーション用ベクターに変換できます。

環状プラスミドへのインサートのクローニングの場合:

• プラスミドは再環状化する必要があるため、使用する DNA の総濃度は 10 μg/ml 未満にする必要があります。
• インサートとベクターのモル比は通常 3:1 程度で使用されます。非常に高い比率では、複数のインサートが生成される場合があります。比率はインサートのサイズに応じて調整される場合があり、1:1 などの他の比率が使用される場合もあります。

場合によっては、連結反応で目的の連結生成物が生成されないことがあり、その理由としては次のようなものが考えられます。

• 損傷したDNA – ライゲーション用のDNAを準備する際に紫外線に過度にさらされると、DNAが損傷し、形質転換効率が大幅に低下する可能性があります。長時間にわたってUVトランスイルミネーターでDNAを操作する必要がある場合は、DNAへの損傷が少ない高波長の紫外線（365 nm）を使用する必要があります。ただし、シチジンまたはグアノシンを1mMの濃度で電気泳動バッファーに添加すると、DNAを損傷から保護できる場合があります。^[24]
• CIAP の誤った使用、または CIAP の非効率的な不活性化または除去。
• 使用されたDNAの量が多すぎます。
• 不完全なDNA 消化– ベクター DNA が不完全に消化されると、バックグラウンドが高くなります。これは、コントロールとしてインサートなしでライゲーションを行うことで確認できます。完全に消化されていないインサートも、適切にライゲーションされず、環状化されません。PCR 産物を消化する場合、多くの制限酵素は効率的な消化のために最小限の数の追加塩基対を必要とするため、PCR に使用するオリゴヌクレオチドの 5' 末端に十分な追加塩基が追加されていることを確認してください。必要な最小塩基対に関する情報は、New England Biolabsのカタログなど、制限酵素の供給元から入手できます。^[25]
• 不完全なライゲーション – 平滑末端DNA（例：SmaI）や融点の低い粘着末端DNA（例： NdeI）では、より多くのリガーゼとより長いインキュベーション時間が必要となる。 ^[26]
• 連結された遺伝子挿入物から発現されたタンパク質は細胞に対して毒性があります。
• 挿入物内の配列がプラスミド DNA 内の配列と相同であるため、削除が発生します。
• 高濃度のEDTAまたは塩は阻害剤として作用する。^[27]

市販の DNA クローニング キットの多くは、通常の DNA リガーゼを必要としない他のライゲーション方法を使用しています。これらの方法を使用すると、クローニングをはるかに迅速に実行できるだけでなく、クローン化された DNA インサートを別のベクターに簡単に転送できます。ただし、これらの方法では特別に設計されたベクターとコンポーネントを使用する必要があり、柔軟性に欠ける場合があります。

ライゲーションにはリガーゼの代わりにトポイソメラーゼを使用することができ、ベクターやインサートの制限消化を必要とせずにクローニングをより迅速に行うことができます。このTOPOクローニング法では、線状ベクターの末端にトポイソメラーゼIを結合させることで活性化され、この「TOPO活性化」ベクターはPCR産物の5'末端の両方にライゲーションすることでPCR産物を受け入れることができ、トポイソメラーゼが放出され、その過程で環状ベクターが形成されます。^[28]

リガーゼを使わないクローニングのもう一つの方法は、例えばゲートウェイクローニングシステムで使用されているDNA組み換えによるものである。^{[29] [30]}クローニングベクター（この方法ではエントリークローンと呼ばれる）にクローニングされた遺伝子は、組み換えによって様々な発現ベクターに簡単に導入することができる。^[31]

研究対象生物には、さまざまな種類のリガーゼが存在します。たとえば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）依存性リガーゼは、 20世紀後半に大腸菌として知られる細菌から発見され、単離されました。それ以来、このモデルはDNAリガーゼファミリーの研究に広く使用されてきました。さらに、このリガーゼはすべての細菌に存在します。大腸菌に存在する遺伝子の例としては、細菌の増殖に影響を与える重要な機能を持つLigAやLigBなどがあります。^[32]

ヒトを含む哺乳類では、Lig1、Lig3、Lig4の3つの遺伝子が同定されています。すべての真核生物には、Lig遺伝子によってコードされる複数のタイプのDNAリガーゼが含まれています。^[33]知られている最小の真核生物リガーゼは、クロレラウイルスDNAリガーゼ（ChVLig）です。これは、わずか298個のアミノ酸で構成されています。ChVLigが細胞内の唯一のリガーゼ源である場合、それは有糸分裂の発達と出芽酵母の非相同末端結合をサポートし続けることができます。^[34] DNAリガーゼI（Lig1）は、岡崎フラグメントの連結に責任があります。これは919個のアミノ酸で構成されています。DNA複製の複雑なプロセスにおいて、DNAリガーゼIはタンパク質相互作用によって複製機構にリクルートされます。Lig1は、植物と酵母の細胞分裂で役割を果たしています。Lig1遺伝子のノックアウトは、酵母といくつかの植物の芽にとって致命的です。しかしながら、マウスの胚発生に関する研究では、成長過程の中期までは胚はDNAリガーゼIなしで発達することが示されている。^[35]

酵素ライゲーションは、DNAナノ構造に関連するさまざまな研究で使用されており、効率と安定性の向上につながっています。方法の1つは、共有DNA結合、すなわちホスホジエステル結合とニックのシーリングです。これらの構造の再構築は、ライゲーションの助けを借りて行われます。たとえば、T4 DNAリガーゼは、DNAの3プライム末端と5プライム末端の間のニックをシーリングして強力なホスホジエステル結合を形成する触媒として機能します。ライゲーションされた構造は、より高い熱安定性値を持ちます。^[36] T4 DNAリガーゼには、すでに述べた触媒などの多くの貴重な特性がありますが、DNA鎖間のギャップのシーリング、ニッククローズ活性、DNA損傷の修復なども担っています。^[2]

ナノ構造のアーキテクチャでは、分子生物学研究において、ssDNA は重要な応用モデルです。T4 DNA リガーゼは短い ssDNA フラグメントを環化するために使用されますが、プロセスは二次構造の形成によって複雑になります。一方、Taq DNA リガーゼは、高温 (それぞれ 45、55、65 °C) で適用できる耐熱性酵素です。これらの温度範囲では二次構造があまり安定しないため、オリゴヌクレオチドの環化効率が向上します。ナノ構造の運動学的、生物学的、およびその他のパラメータは、DNA リング内の二次構造の存在によって影響を受けます。ただし、Taq DNA ライゲーションは、2 つの相補的な DNA 鎖が完全にペアになっていて、間にギャップがない場合にのみ発生します。^[37]

リガーゼ活性、変異、欠損の分析は、疾患、病状の進行、および関連するまれな後天性または遺伝性症候群（DNAリガーゼIV症候群など）を調査するための医薬品設計および生物学的研究で広く使用されています。^{[38] [39] [40] [41]}

ライゲーション手順は分子生物学のクローニング技術で普及しており、ライガーゼ連鎖反応（LCR）またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくライゲーションプローブの増幅を使用してゲノム内の特定のヌクレオチド配列を定義および特徴付けるために適用されてきました。^[42]

ライゲーションはDNA分析法としても用いられる。^[43]いくつかの技術ではローリングサークル増幅法が用いられる。^[43]これらの中で最も注目すべきものは、蛍光in situハイブリダイゼーションとペプチド核酸を用いたSmolinaら、2007年とSmolinaら、2008年の論文である。^[43]彼らはこの技術を開発し、細菌染色体の分析に用いた。^[43]

• ライゲーション非依存クローニング
• ヌクレアーゼ