デオキシリボヌクレアーゼ

デオキシリボヌクレアーゼ（略してDNase ）は、 DNA骨格のホスホジエステル結合の加水分解を触媒し、DNA を分解する酵素である糖タンパク質エンド ヌクレアーゼのグループを指します。細胞における DNase 酵素の役割には、細胞のアポトーシス、壊死、および好中球細胞外トラップ(NET) によって排出される細胞外 DNA (ecDNA) を分​​解して、そうでなければ誘発される炎症反応を軽減することが含まれます。さまざまなデオキシリボヌクレアーゼが知られており、基質特異性、化学的メカニズム、および生物学的機能が異なる 2 つのファミリー ( DNase IまたはDNase II )のいずれかに分類されます。DNase の研究室での用途には、原核生物から抽出されたタンパク質の精製が含まれます。さらに、DNase は血漿中の ecDNA によって引き起こされる疾患の治療薬として応用されています。 DNase のアッセイも研究分野で登場しつつあります。

動物に見られる DNase の 2 つの主なタイプは、デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I) とデオキシリボヌクレアーゼ II (DNase II) として知られています。これら 2 つのファミリーには、それぞれサブカテゴリがあります。

最初のDNaseセットはDNase Iです。このファミリーはDNase I、DNase1L1、DNase 1L2、およびDNase1L3で構成されています。DNase IはDNAを切断して、5'-リン酸化末端と3'-ヒドロキシ末端を持つ2つのオリゴヌクレオチド末端産物を形成し、主に消化器系の器官によって生成されます。DNase Iファミリーは、活性化因子としてCa2+およびMg2+カチオンを必要とし、選択的に発現します。^[1] pHに関しては、DNase Iファミリーは、約6.5〜8の通常のpHで活性です。

2番目のDNA分解酵素セットはDNase IIです。このファミリーはDNase II αとDNase II βで構成されています。DNA分解酵素Iと同様に、DNA分解酵素IIはDNAを切断して、5'-ヒドロキシ末端と3'-リン酸化末端を持つ2つのオリゴヌクレオチド末端産物を形成します。このタイプのDNA分解酵素は、マクロファージでの発現が高く、細胞タイプの発現が限られているため、組織でより広く発現しています。DNA分解酵素Iとは異なり、活性化因子としてCa2+およびMg2+カチオンを必要としません。^[2] pH に関しては、DNA分解酵素IIファミリーは酸性pHで発現します。DN分解酵素IIの切断パターンはジメチルスルホキシド（DMSO）の存在下で変化し、DNAの構造に大きな影響を与えます。

DNase I と II はどちらも糖タンパク質エンドヌクレアーゼですが、DNase I は炭水化物側鎖を持つ単量体サンドイッチ型構造を持ち、DNase II は二量体 四次構造を持ちます。

DNase I の構造: DNase I は分子量 30,000 Da の糖タンパク質で、8～10 残基の糖鎖が Asn18 (オレンジ) に結合しています。^[3]これは 2 つの 6 本鎖 𝛽 プリーツ シートを持つ 𝛼,𝛽 タンパク質で、これが構造の核を形成しています。^[4]これら 2 つのコア シートは平行に走り、他のすべてのシートは反平行に走ります。𝛽 プリーツ シートは構造の中心にあり、𝛼 ヘリックスは周辺のコイルで示されます。DNase I には 4 つのイオン結合ポケットがあり、二本鎖 DNA を加水分解するためにCa ²⁺と Mg ^{2+ が必要です。 [5]} 2 つの部位は Ca ²⁺と強く結合し、他の 2 つは Mg ²⁺と協調します。 Mg ²⁺結合部位の数と位置についてはほとんど公表されていないが、Mg ^{2+ は}触媒ポケットの近くにあり、加水分解に寄与しているという説がある。^[6] 2つのCa ^{2+ は}画像で赤で示されている。これらは結晶化条件下でDNase Iに結合し、表面ループAsp198からThr204（シアン）を安定化し、柔軟なループ内の高熱移動領域を残基Gly97からGly102（黄色）に限定することで、分子の構造的完全性にとって重要である。

DNase II 構造: DNase II には、U 字型のクランプ構造内で二本鎖 DNA を結合できるホモ二量体四次構造が含まれています。U 字型のクランプの内部は主に電気陽性であり、負に帯電した DNA を結合できます。DNase I と同様に、DNase II 構造は、9 つ​​の 𝛼 ヘリックスと 20 の 𝛽 プリーツシートを持つ混合 𝛼/𝛽 二次構造で構成されています。^[7] DNase I とは異なり、DNase II は触媒に二価金属イオンを必要としません。^[7]構造はプロトマー A (シアン) とプロトマー B (緑) で構成されています。各構造は 2 つの触媒モチーフで構成され、簡潔にするためにプロトマー B にラベルが付けられています。His100 と Lys102 が最初のモチーフ (青) を構成し、His279 と Lys281 が 2 番目の触媒モチーフ (赤) を構成します。

一部の DNase は、DNA 分子の末端の残基のみを切断、つまり「切断」します。このタイプのエキソヌクレアーゼは、エキソデオキシリボヌクレアーゼとして知られています。他の DNase は、鎖のどこでも切断し、エンドデオキシリボヌクレアーゼ(エンドヌクレアーゼのサブセット) として知られています。^{[8]一部の DNase は、切断する}DNA 配列 についてほとんど区別しませんが、制限酵素などの他の DNase は、配列に非常に特異性があります。他の DNase は、二本鎖 DNAのみを切断し、他の DNase は一本鎖分子に特異的であり、また他の DNase は両方に対して活性があります。

DNaseの作用は3段階で起こる。最初の段階では、ホスホジエステル骨格に複数の切り込みが導入される。第2段階では、酸可溶性ヌクレオチドが生成される。第3段階は終末段階で、オリゴヌクレオチドの還元によりUVデータに濃色シフトが生じる。 ^[9]

DNase I は主に二本鎖 DNA を標的とし、程度は低いが一部の一本鎖 DNA も切断する。DNase I は、片方の鎖のホスホジエステル結合を切断することで非特異的 DNA 切断を触媒する。切断部位は 3'-酸素原子と隣接するリン原子の間にあり、リン原子で配置が反転した 3'-ヒドロキシルおよび 5'-ホスホリルオリゴヌクレオチドを生成する。DNase 酵素は、適切に機能するために二価 カチオン(通常は Ca ²⁺ ) の存在に依存する。DNase I の活性部位には、2 つのヒスチジン残基 (His134 と His252) と 2 つの酸性残基 ( Glu 78 とAsp 212) が含まれており、これらはすべてホスホジエステル結合の一般的な酸塩基触媒に重要である。^[10]

デオキシリボヌクレアーゼ II (DNase II) は、高等真核生物に典型的に見られるリソソームの低 pH 環境で最適な活性を示すため、酸性デオキシリボヌクレアーゼとしても知られています。組み換え DNase II のいくつかの形態は、真核生物の DNase II と同様に、二価金属イオンが存在しない低 pH で高いレベルの活性を示します。^[7] DNase I とは異なり、DNase II は 5'-酸素原子と隣接するリン原子の間のホスホジエステル結合を切断し、3΄-リン酸化ヌクレオチドと 5΄-ヒドロキシルヌクレオチドを生成します。

DNaseは、原核生物から抽出されたタンパク質を精製する際によく使用されます。タンパク質の抽出には、細胞膜の分解が伴うことがよくあります。分解されて脆くなった細胞膜が溶解し、不要なDNAと目的のタンパク質が放出されることがよくあります。結果として得られるDNAタンパク質抽出物は粘性が高く、精製が困難なため、DNaseを加えて分解します。^[11] DNAは加水分解されますが、タンパク質は影響を受けず、抽出物をさらに精製することができます。

細胞外 DNA (ecDNA) は、血液循環中に存在する DNA です。これは、血液および組織細胞のアポトーシス、壊死、または好中球細胞外トラップ(NET) 症の結果として出現しますが、生きた細胞からの活発な分泌物から発生することもあります。ecDNA とそれらの指定されたDNA 結合タンパク質は、 DNA 感知受容体、パターン認識受容体(PRR) を活性化することができます。PRR は、炎症性免疫反応を引き起こす経路を刺激することができます。その結果、炎症性疾患に関するいくつかの研究では、血漿中に高濃度の ecDNA があることがわかりました。このため、DNase は血漿中の ecDNA を減らすための可能な治療法であることが証明されています。DNase は細胞内外の両方に排泄され、DNAホスホジエステル結合を切断することができます。この機能を使用して ecDNA 濃度を低く維持し、炎症を治療することができます。血液中のDNA残留物に起因する病気は、DNaseの「分解特性」を利用して標的とされてきました。研究では、DNaseが粘液の粘度を下げることで治療薬として作用できることが示されています。^{[12] [13]} DNaseの投与は病気によって異なります。経口、胸膜内、静脈内、腹腔内、吸入で投与できます。^[14]いくつかの研究では、治療や健康状態を監視する方法としてのDNaseの応用を検討し続けています。たとえば、最近、病原菌由来のDNaseが創傷感染監視の指標として使用されています。^[15]

嚢胞性線維症は、粘液、汗、消化液の生成に影響を及ぼし、潤滑剤というよりは粘性が増す遺伝性疾患です。嚢胞性線維症患者は、ネブライザーを使用して DNase 酵素を吸入することができます。DNase 酵素が役立つのは、白血球が粘液に蓄積し、分解されると DNA が放出され、粘液の「粘着性」が増すためです。DNase 酵素が DNA を分解すると、粘液が肺から除去されやすくなります。具体的には、FDA 承認薬Pulmozyme (別名 dornase alfa) としても知られる DNase I は、肺機能を高める治療薬として使用されます。

喘息^[16] 、胸膜膿胸[ ^12]、慢性閉塞性肺疾患などの他の呼吸器疾患もDNaseの特性によって良い影響を受けることがわかっています。

さらに、最近の研究では、血栓の分解を担うタンパク質である胸膜内組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）をデオキシリボヌクレアーゼと組み合わせると、胸水が増加し、入院期間が短縮し、肺炎随伴性胸水および膿胸における手術の必要性が減少することが示されています。

敗血症は、感染に対する身体の極端な反応によって引き起こされる、生命を脅かす炎症性疾患です。炎症反応が人体を包み込むと、身体は自分自身を攻撃し始めます。その結果、血流中の ecDNA レベルが高くなるため、研究者は適切な治療薬として DNase に注目しました。研究により、DNase は NET を破壊し、炎症反応を減少させるのに効果的であることが示されています。DNase を正式な治療薬としてさらに確立するには、投与の種類と時期に関するさらなる研究が必要です。 ^{[17] [18] [19]}

全身性エリテマトーデス（SLE）は自己免疫疾患で、自己抗体の生成により炎症が起こり、臓器、関節、腎臓に損傷を与えます。SLE は、アポトーシス細胞がこの疾患の自己抗原となるしています。DNase I は、人体におけるアポトーシス破片の量を減らす可能性のある治療法として研究されてきました。この治療法が困難なのは、酵素がクロマチンの細胞膜を分解できないためではないかと示唆されています。この治療法については相反する結果が出ていますが、DNase I の治療効果を調べるためのさらなる研究が行われています。 ^{[14] [18] [20]}

抗腫瘍治療。DNaseは DNA を分解する能力があるため、抗腫瘍効果があることが知られています。がん患者の血液中には高レベルの DNA が含まれていることがわかっており、DNase I が治療薬として有効である可能性を示唆しています。ecDNA がなぜこれほど高レベルなのか、また DNase が効果的な治療薬として作用するかどうかについては、まだ解明されていません。いくつかのマウス研究では、静脈内 DNase I を使用した抗腫瘍の進行に肯定的な結果が示されています。ただし、一般に導入される前に、さらに調査を行う必要があります。^{[21] [14]}

DNA は、260 nm 付近で最大吸収波長の紫外線 (UV)を吸収します。この吸収は、DNA の芳香族塩基のπ 電子によるものです。dsDNA、または二本鎖構造が発生するRNA領域では、塩基が互いに平行に積み重ねられ、塩基分子軌道の重なりによりUV 光の吸収が減少します。この現象は、ハイポクロミック効果と呼ばれます。DNase が dsDNA からヌクレオチドを遊離すると、塩基は dsDNA のように積み重ねられなくなり、軌道の重なりが最小限に抑えられ、UV 吸収が増加します。この吸収の増加は、DNase 活性の Kunitz 単位の基礎となります。 1クニッツ単位は、1 mg/mlのサケ精子DNAに添加された酵素の量として定義され、0.1 M NaOAc（pH 5.0）緩衝液中で25℃で高度に重合したDNAに作用し、波長260 nmで毎分0.001の吸光度の増加を引き起こす。この単位の名前は、1946年に標準試験を提案したロシア系アメリカ人の生化学者モーゼス・クニッツにちなんで名付けられた。 ^[22]

DNA 調製物と溶液中のそれらの重合度の標準化は不可能である ため、標準酵素調製物は未知のものと並行して実行する必要があります。

シングルラジアル酵素拡散法（SRED） このシンプルなDNase I活性測定法は、ナダノらによって導入され、ゲルに打ち込まれたサンプル中に存在するDNaseによるアガロースゲル中のDNAの消化に基づいています。 ^{[14] DNase活性は、}エチジウムブロマイドで染色されたDNAが均一に分布しているアガロースゲル層に分配された円形のウェルのサイズで表されます。インキュベーション後、酵素がウェルからゲルに放射状に拡散してDNAを切断するため、円形の暗い領域が形成されます。SREDは、エチジウムブロマイドをSYBR Green Iまたは他のDNAゲル染色剤に置き換えるなど、感度と安全性の向上につながる多くの改良を受けました。^[23]

比色法によるDNase I活性アッセイ

キネティック比色法によるDNase I活性アッセイは、ヒト組み換えDNase I（プルモザイム）の安定性を評価するために開発された。この方法は、DNA/メチルグリーン複合体の分解に基づく比色エンドポイント酵素活性アッセイから調整されたものである。^[24]

• 細胞外DNA（ecDNA）
• デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I)
• デオキシリボヌクレアーゼ II (DNase II)
• エンドヌクレアーゼ
• 酵素
• 加水分解
• ホスホジエステル結合

• 米国国立医学図書館の医学件名標目(MeSH)におけるデオキシリボヌクレアーゼ
• Thermo Fisher Scientific Inc.のデオキシリボヌクレアーゼ (DNase)ウェブサイト
• Sigma-Aldrich Solutions の Web サイトからデオキシリボヌクレアーゼ I を取得
• デオキシリボヌクレアーゼ I、活性部位（InterProウェブサイトより）