Molecular cloning

非常に多くの宿主生物と分子クローニングベクターが使用されているが、分子クローニング実験の大部分は、細菌E. coli（Escherichia coli）の実験室株とプラスミドクローニングベクターから始まる。E . coliとプラスミドベクターは、技術的に高度で汎用性が高く、広く入手可能であり、最小限の設備で組換え生物を迅速に増殖させることができるため、一般的に使用されている。^{[ 3 ]}クローニングするDNAが非常に大きい場合（数十万から数百万の塩基対）、細菌人工染色体^{[ 10 ]}または酵母人工染色体ベクターが選択されることが多い。

特殊な用途では、特殊な宿主ベクターシステムが必要となる場合があります。例えば、実験者が組換え生物から特定のタンパク質を採取したい場合、目的の宿主生物における転写および翻訳に適したシグナルを含む発現ベクターが選択されます。あるいは、異なる種でDNAを複製したい場合（例えば、細菌から植物へのDNAの転移）、複数の宿主域を持つベクター（シャトルベクターとも呼ばれる）が選択されることがあります。しかし実際には、特殊な分子クローニング実験は通常、細菌プラスミドへのクローニングから始まり、続いて特殊なベクターへのサブクローニングが行われます。

宿主とベクターの組み合わせがどのようなものであっても、ベクターにはその機能と実験的有用性に極めて重要な4つのDNAセグメントがほぼ必ず含まれている。^{[ 3 ]}

• ベクター（およびそれに連結された組換え配列）が宿主生物内で複製するためには、DNA複製起点が必要である。
• 外来DNAを導入できる部位として機能する、1つ以上の固有の制限酵素認識部位
• ベクター配列を取り込んだ細胞の生存を可能にするために使用できる選択可能な遺伝子マーカー遺伝子
• 外来DNAを含む細胞をスクリーニングするために使用できるタグ遺伝子

クローニングベクターは、外来DNAが挿入される部位でDNAを切断するために制限エンドヌクレアーゼで処理されます。制限酵素は、切断部位で外来DNAの末端と適合する構成を生成するように選択されます（DNA末端を参照）。通常、これは、ベクターDNAと外来DNAを同じ制限酵素または制限エンドヌクレアーゼで切断することによって行われます。たとえば、EcoRIという制限酵素はE.coliから単離されました。^{[ 11 ]}最新のベクターのほとんどは、ベクター分子内で一意のさまざまな便利な切断部位を含んでおり（ベクターは単一の部位でのみ切断できます）、遺伝子（多くの場合β-ガラクトシダーゼ）内に位置しており、その不活性化はプロセスの後の段階で組換え生物と非組換え生物を区別するために使用できます。組換え生物と非組換え生物の比率を改善するために、切断されたベクターは、ベクター末端を脱リン酸化する酵素（アルカリホスファターゼ）で処理されることがあります。末端が脱リン酸化されたベクター分子は複製できず、切断部位に外来DNAが組み込まれた場合にのみ複製が回復する。^{[ 12 ]}

ゲノムDNAのクローニングでは、クローニングするDNAは目的の生物から抽出されます。DNAが著しく分解されていない限り、事実上あらゆる組織源（絶滅した​​動物の組織でさえも）を使用できます^{[ 13 ]}。次に、DNAは、汚染タンパク質（フェノール抽出）、RNA（リボヌクレアーゼ）、およびより小さな分子（沈殿および/またはクロマトグラフィー）を除去するための簡単な方法を使用して精製されます。分子クローニングの前に、特定のDNAまたはRNA（ RT-PCR ）配列を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法がよく使用されます。

クローニング実験用のDNAは、逆転写酵素を用いてRNAから得ることも（相補的DNAまたはcDNAクローニング）、合成DNAの形で得ることもできる（人工遺伝子合成）。cDNAクローニングは通常、目的の細胞のmRNA集団を代表するクローンを得るために用いられるが、合成DNAは設計者によって定義された任意の正確な配列を得るために用いられる。このような設計された配列は、遺伝子を遺伝暗号間で移動させる場合（例えば、ミトコンドリアから核へ）^{[ 14 ]} 、あるいは単にコドン最適化によって発現を増加させる場合^{[ 15 ]}に必要となることがある。

精製されたDNAは、制限酵素で処理され、ベクターの末端に連結可能な末端を持つ断片が生成される。必要に応じて、目的の制限部位を含む短い二本鎖DNA断片（リンカー）を追加して、ベクターと適合する末端構造を作成することができる。^{[ 3 ] [ 12 ]}

組換えDNAの作製は、分子クローニングプロセスの中で最も単純なステップと言えるでしょう。ベクター由来のDNAと外来由来のDNAを適切な濃度で混合し、DNAリガーゼという酵素を用いて末端同士を共有結合させるだけです。この結合反応はライゲーションと呼ばれます。こうして得られた、末端がランダムに結合したDNA混合物は、宿主生物への導入準備が整います。

DNAリガーゼは線状DNA分子の末端のみを認識して作用するため、通常は末端がランダムに結合したDNA分子の複雑な混合物が生成されます。目的の産物（ベクターDNAと外来DNAが共有結合したもの）は存在しますが、他の配列（例えば、外来DNAが自身に結合したもの、ベクターDNAが自身に結合したもの、ベクターDNAと外来DNAの高次結合など）も通常は存在します。この複雑な混合物は、DNA混合物が細胞に導入された後、クローニングプロセスの次の段階で選別されます。^{[ 3 ] [ 12 ]}

試験管内で操作されたDNA混合物は、宿主生物と呼ばれる生きた細胞に戻されます。細胞にDNAを導入する方法は様々で、分子クローニングプロセスのこのステップに付けられる名称は、選択された実験方法によって異なることがよくあります（例：形質転換、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション）。^{[ 3 ] [ 12 ]}

微生物が周囲の環境からDNAを取り込んで複製できる場合、そのプロセスは形質転換と呼ばれ、DNAを取り込むことができる生理的状態にある細胞はコンピテントであると言われます。^{[ 16 ]}哺乳類細胞培養では、細胞にDNAを導入する同様のプロセスは、一般的にトランスフェクションと呼ばれます。形質転換とトランスフェクションの両方とも、通常、使用する特定の種や細胞の種類に応じて異なる特別な増殖レジメンと化学処理プロセスによる細胞の準備が必要です。

電気穿孔法は、高電圧の電気パルスを用いてDNAを細胞膜（および存在する場合は細胞壁）を越えて移動させる方法です。^{[ 17 ]}一方、形質導入法は、DNAをウイルス由来の粒子にパッケージ化し、これらのウイルス様粒子を用いて、ウイルス感染に似たプロセスでカプセル化されたDNAを細胞内に導入する方法です。電気穿孔法と形質導入法は高度に特殊化された方法ですが、DNAを細胞内に移動させる最も効率的な方法である可能性があります。

いずれの方法を用いるにせよ、選択した宿主生物への組換えDNAの導入は通常効率の低いプロセスである。つまり、実際にDNAを取り込む細胞はごくわずかである。実験科学者はこの問題を人工遺伝子選択のステップで解決する。このステップでは、DNAを取り込んでいない細胞を選択的に殺し、ベクターによってコード化された選択マーカー遺伝子を含むDNAを活発に複製できる細胞だけが生き残る。^{[ 3 ] [ 12 ]}

細菌細胞を宿主生物として用いる場合、選択マーカーは通常、細胞を死滅させる抗生物質（典型的にはアンピシリン）に対する耐性を付与する遺伝子である。プラスミドを持つ細胞は抗生物質に曝露されても生存するが、プラスミド配列を取り込まなかった細胞は死滅する。哺乳類細胞（ヒト細胞やマウス細胞など）を用いる場合も同様の戦略が用いられるが、マーカー遺伝子（この場合は通常kanMXカセットの一部としてコードされている）は抗生物質ジェネティシンに対する耐性を付与する。

Modern bacterial cloning vectors (e.g. pUC19 and later derivatives including the pGEM vectors) use the blue-white screening system to distinguish colonies (clones) of transgenic cells from those that contain the parental vector (i.e. vector DNA with no recombinant sequence inserted). In these vectors, foreign DNA is inserted into a sequence that encodes an essential part of beta-galactosidase, an enzyme whose activity results in formation of a blue-colored colony on the culture medium that is used for this work. Insertion of the foreign DNA into the beta-galactosidase coding sequence disables the function of the enzyme so that colonies containing transformed DNA remain colorless (white). Therefore, experimentalists are easily able to identify and conduct further studies on transgenic bacterial clones, while ignoring those that do not contain recombinant DNA.

The total population of individual clones obtained in a molecular cloning experiment is often termed a DNA library. Libraries may be highly complex (as when cloning complete genomic DNA from an organism) or relatively simple (as when moving a previously cloned DNA fragment into a different plasmid), but it is almost always necessary to examine a number of different clones to be sure that the desired DNA construct is obtained. This may be accomplished through a very wide range of experimental methods, including the use of nucleic acid hybridizations, antibody probes, polymerase chain reaction, restriction fragment analysis and/or DNA sequencing.^[3][12]

Molecular cloning has led directly to the elucidation of the complete DNA sequence of the genomes of a very large number of species and to an exploration of genetic diversity within individual species, work that has been done mostly by determining the DNA sequence of large numbers of randomly cloned fragments of the genome, and assembling the overlapping sequences.

個々の遺伝子レベルでは、分子クローンを用いてプローブを作製し、遺伝子の発現様式や、その発現が代謝環境、細胞外シグナル、発生、学習、老化、細胞死といった生物学的プロセスとどのように関連しているかを解析します。クローン化された遺伝子は、研究者が遺伝子を不活性化したり、局所変異誘発や部位特異的変異誘発を用いてより微細な変異を導入したりすることで、個々の遺伝子の生物学的機能や重要性を解析するためのツールとしても利用できます。機能クローニングのために発現ベクターにクローン化された遺伝子は、発現タンパク質の機能に基づいて遺伝子をスクリーニングする手段となります。

遺伝子の分子クローンを取得することで、クローン化された遺伝子のタンパク質産物（組換えタンパク質と呼ばれる）を産生する生物を開発することが可能になる。しかし実際には、遺伝子をクローン化するよりも、活性型の組換えタンパク質を望ましい量で産生する生物を開発する方がはるかに難しい場合が多い。これは、遺伝子発現に関わる分子シグナルが複雑かつ多様であること、そしてタンパク質の折り畳み、安定性、輸送が非常に困難な課題であることに起因する。

^現在、多くの有用なタンパク質が組換え製品として入手可能です。これらには、(1) 投与によって欠陥のある遺伝子や発現の不十分な遺伝子を修正できる医学的に有用なタンパク質（例：一部の血友病で欠乏している血液凝固因子である組換え第VIII因子[ ^{18 ]}、および一部の糖尿病の治療に使用される組換えインスリン^{[ 19 ]}）、(2) 生命を脅かす緊急事態を支援するために投与できるタンパク質（例：脳卒中の治療に使用される組織プラスミノーゲン活性化因子^{[ 20 ]}）、(3) 精製されたタンパク質を使用して感染性病原体自体に患者を曝露することなく感染症に対する免疫を与えることができる組換えサブユニットワクチン（例：B型肝炎ワクチン^{[ 21 ]}）、および(4) 診断検査の標準物質としての組換えタンパク質が含まれます。

クローン化された遺伝子は、適切な発現のためのシグナルを提供するように特性が明らかにされ、操作されると、生物に挿入されて遺伝子組み換え生物（遺伝子組み換え生物、GMOとも呼ばれる）が生成されます。ほとんどのGMOは基礎生物学研究の目的で生成されますが（例えば、遺伝子組み換えマウスを参照）、医薬品やその他の化合物を生産する動物や植物（ファーミング）、除草剤耐性作物、家庭用娯楽用の蛍光熱帯魚（グローフィッシュ）など、商業利用のために開発されたGMOも数多くあります。^{[ 1 ]}

遺伝子治療とは、遺伝性疾患や後天性疾患を治療することを目的として、その機能が欠如している細胞に機能する遺伝子を供給することです。遺伝子治療は大きく2つのカテゴリーに分けられます。1つ目は生殖細胞、つまり精子または卵子の改変で、生物全体と後世代に永続的な遺伝子変化をもたらします。この「生殖細胞系遺伝子治療」は、多くの人から人間に対しては非倫理的だと考えられています。^{[ 22 ]} 2つ目のタイプの遺伝子治療である「体細胞遺伝子治療」は、臓器移植に似ています。この場合、1つまたは複数の特定の組織が、直接治療または組織の除去、研究室での治療遺伝子の導入、および治療された細胞を患者に戻すことによって標的とされます。体細胞遺伝子治療の臨床試験は1990年代後半に始まり、主に癌、血液、肝臓、肺の疾患の治療を目的としていました。^{[ 23 ]}

多大な宣伝と約束にもかかわらず、ヒト遺伝子治療の歴史は比較的限られた成功しか収めていない。^{[ 23 ]}細胞に遺伝子を導入しても、治療対象疾患の症状が部分的かつ/または一時的に緩和されるだけの場合が多い。遺伝子治療の治験患者の中には、死亡を含む治療自体の有害な結果を被った人もいる。場合によっては、有害事象は挿入不活化によって患者のゲノム内の必須遺伝子が破壊されたことに起因する。また、遺伝子治療に使用されるウイルスベクターが感染性ウイルスに汚染されていた場合もある。それでもなお、遺伝子治療は将来有望な医学分野であり、研究開発活動が活発に行われている分野であると考えられている。