DNA断片化

DNA断片化とは、 DNA鎖が分離または切断されて断片になることを指します。これは、実験室の職員や細胞によって意図的に行われる場合もあれば、自然発生的に起こる場合もあります。自然発生的または偶発的なDNA断片化は、細胞内で徐々に蓄積される断片化です。これは、例えばコメットアッセイやTUNELアッセイによって測定できます。

その主な測定単位はDNA断片化指数（DFI）です。^{[ 1 ]} DFIが20%以上になると、ICSI後の成功率が著しく低下します。^{[ 1 ]}

DNA断片化は、1970年にウィリアムソンが新生児肝臓の初代培養における細胞死の際に離散的なオリゴマー断片が生じることを観察した際に初めて記録された。彼は、培養後のマウス肝細胞から分離された細胞質DNAは、135 kDaの倍数からなる分子量を持つDNA断片によって特徴づけられると記述した。この発見は、これらのDNA断片が核DNAの特異的な分解産物であるという仮説と一致していた。^{[ 2 ]}

DNA断片化は、DNA配列のライブラリー構築やサブクローニングの前にしばしば必要となる。DNAを機械的に切断するさまざまな方法が用いられており、実験室の担当者によってDNAが断片化されている。そのような方法には、超音波処理、ニードルせん断、ネブライザー処理、ポイントシンクせん断、圧力セル通過などがある。^{[ 3 ]}

• 制限酵素消化は、実験室で意図的にDNA鎖を切断することです。これは、バイオテクノロジーでDNAをより小さな鎖に切断するために用いられる酵素ベースの処理であり、個体間の断片長の差異を研究したり、遺伝子クローニングに使用されます。^{[ 4 ]} この方法は、両方の鎖を同時に切断するか、dsDNAの各鎖にニックを生成してdsDNA切断を生成することによってDNAを断片化します。^{[ 5 ]}
• DNAライブラリーに照射される高周波音響エネルギー波の伝達における音響せん断。トランスデューサはボウル型になっており、波が目的のターゲットに収束するようになっている。^{[ 5 ]}
• ネブライザー装置では、DNAを小さな穴を通して噴霧し、微細な霧状にして回収します。断片のサイズは、DNAをネブライザーに通すために使用されるガスの圧力、DNA溶液が穴を通過する速度、溶液の粘度、および温度によって決まります。^{[ 5 ] [ 6 ]}
• 超音波処理は、流体力学的せん断の一種であり、短時間の超音波処理によってDNAに音響キャビテーションと流体力学的せん断を与え、通常700bpの断片を生成します。DNA断片化には、プローブ型超音波処理装置を使用してバーストサイクルで超音波処理を適用するのが一般的です。^{[ 7 ]}
• ポイントシンクせん断は、流体力学的せん断の一種で、シリンジポンプを使用してDNAライブラリーを小さな急激な収縮部を通して押し出すことで流体力学的せん断力を発生させます。断片の長さの約90%は2倍の範囲内に収まります。^{[ 5 ]}
• ニードルせん断は、DNAライブラリーを細いゲージの針に通すことでせん断力を発生させます。^{[ 5 ]} DNAはゲージの針を何度も通過し、物理的にDNAを細かい断片に引き裂きます。
• フレンチプレスセルは、高圧下で狭いバルブを通してDNAを通過させることで、高いせん断力を発生させます。^{[ 5 ]}フレンチプレスでは、ピストン圧力を調整することでせん断力を慎重に制御できます。プレスは最大せん断力の点を一度通過させるため、他の破壊方法で発生する繰り返しせん断による繊細な生物学的構造への損傷を制限します。
• トランスポソームを介した断片化（タグメンテーション）では、トランスポソームはDNAと混合して作製され、その後DNAが切断されることで、転移反応によってアダプターが付加された断片化DNAが生成されます（挿入ではなく）。トランスポソームとDNAの相対濃度は適切でなければなりません。

アポトーシスDNA断片化は、細胞がアポトーシス（プログラム細胞死）で実行する自然な断片化です。DNA断片化は、アポトーシスの生化学的特徴です。死滅する細胞では、DNAはエンドヌクレアーゼによって切断され、クロマチンがヌクレオソーム単位に断片化されます。ヌクレオソーム単位は約180 bpのオリゴマーの倍数であり、アガロースゲルで泳動するとDNAラダーとして現れます。^{[ 8 ]}アポトーシスDNA断片化に関与する酵素は、カスパーゼ活性化DNaseです。CADは通常、別のタンパク質であるカスパーゼ活性化DNase阻害因子（ICAD）によって阻害されています。アポトーシス中、アポトーシスエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ3がICADを切断し、CADを活性化させます。^{[ 9 ]}

CADは、クロマチン中に約180塩基対間隔で存在するタンパク質構造であるヌクレオソーム間のリンカー部位でDNAを切断します。これは、DNAが通常、ヌクレオソームのコアタンパク質であるヒストンにしっかりと巻き付いているためです。リンカー部位は、DNA鎖の中で唯一露出しており、CADがアクセスできる部分です。

精子運動障害のある男性は、精子DNA断片化のレベルが高いことが多い。^{[ 10 ]} 精子細胞のDNA断片化の程度は、体外受精^{[ 11 ]}（IVF）およびその拡大体細胞質内精子注入^{[ 1 ]}（ICSI）の結果を予測することができる。精子クロマチン分散テスト（SCD）とTUNELアッセイはどちらも精子DNA損傷の検出に有効である。^{[ 12 ] [ 13 ]}明視野顕微鏡を使用すると、SCDテストはTUNELアッセイよりも感度が高いように見える。^{[ 13 ]}

DNA断片化は、法医学、特にDNAプロファイリングにおいて重要な役割を果たす。

• 制限酵素断片長多型（RFLP）は、制限エンドヌクレアーゼでDNAサンプルを消化することによって生じる様々な長さのDNA断片を分析する技術です。制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位として知られる特定の配列パターンでDNAを切断します。DNAサンプル中の特定の認識部位の有無によって様々な長さのDNA断片が生成され、これらはゲル電気泳動によって分離されます。その後、サンプル中の相補的なDNA配列に結合するDNAプローブとハイブリダイズされます。^{[ 14 ]}
• ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析では、生物学的サンプルから数百万個の正確なDNAコピーが作成されます。これは、DNA鎖の特定の領域（DNAターゲット）を増幅するために使用されます。ほとんどのPCR法は通常、0.1～10キロ塩基対（kb）のDNA断片を増幅しますが、一部の技術では最大40kbのサイズの断片を増幅できます。^{[ 14 ]} PCRでは、熱を使用してDNA鎖を分離します。
• アポトーシス中に断片化されたDNAは、1～20個のヌクレオソームのサイズであり、変性固定剤エタノールで固定された細胞から選択的に分離することができる^{[ 15 ] 。}