細胞破壊

細胞破壊は、消化とも呼ばれ、細胞内から生物学的分子を放出する方法またはプロセスです。

クローニングと培養法を使用して生物学的に興味深い分子を生成することにより、関連する分子の研究と製造が可能になります。排出される分子を除き、興味のある分子を生成する細胞は破壊する必要があります。このページではさまざまな方法について説明します。別の破壊方法は、セルアンルーフングと呼ばれます。

細胞を破壊するための一般的な実験室規模の機械的方法は、直径 0.1～2 mm (0.004～0.08 インチ) のガラス、セラミック、またはスチールのビーズを、水溶液に懸濁したサンプルと混合するものです。1970 年代後半に Tim Hopkins によって初めて開発されたこの方法では、サンプルとビーズの混合物をかき混ぜたり振ったりして、激しく撹拌します。ビーズが細胞サンプルに衝突して細胞を割って細胞内成分を放出します。他の方法とは異なり、均質化中の機械的せん断は中程度であるため、優れた膜または細胞内調製物が得られます。この方法は「ビーズビーティング」とも呼ばれ、胞子から動物や植物の組織まで、あらゆる種類の細胞材料に適しています。これは酵母溶解の最も広く使用されている方法であり、50% をはるかに超える (最大 95%) 破壊をもたらすことができます。^[1]他の機械的細胞破壊方法に比べて、非常に小さなサンプルサイズを破壊でき、交差汚染の心配なく一度に多くのサンプルを処理でき、その過程で潜在的に有害なエアロゾルを放出しないという利点があります。

この方法の最も単純な例では、等量のビーズを試験管内の細胞または組織懸濁液に加え、サンプルを一般的な実験室用ボルテックスミキサーで激しく混合します。処理時間は遅く、特殊な振とう機よりも3～10倍長くかかりますが、簡単に破壊される細胞には適しており、安価です。

ビーズビーティングが成功するかどうかは、振とう機の設計上の特徴（振とう振動周波数、振とう距離、振とう方向、バイアルの方向を考慮）だけでなく、正しいビーズサイズ（直径0.1～6 mm（0.004～0.2インチ））、ビーズ組成（ガラス、セラミック、スチール）、バイアル内のビーズ負荷の選択にも左右されます。

ほとんどの研究室では、ビーズビーティングは1～24本の密封されたプラスチックバイアルまたは遠心管のバッチサイズで行われます。サンプルと小さなビーズは、高出力電気モーターで駆動する特別に設計された往復シェーカーで、毎分約2000回の振動で撹拌されます。細胞破壊は1～3分の振動で完了します。SoniBeastと呼ばれるビーズビーターのバリエーションを使用すると、細胞破壊の速度が大幅に速くなります。従来の機械とは異なり、この機械は毎分20,000回の振動で渦運動を使用してビーズを撹拌します。ディープウェルマイクロタイタープレートを保持する大型のビーズビーターマシンも、ビーズを複数のバイアルまたはマイクロプレートにすばやくロードするように設計されたビーズディスペンサーと同様に、処理時間を短縮します。^{[2] [3]}事前にロードされたバイアルとマイクロプレートも利用できます。

すべての高エネルギービーズビーティングマシンは、サンプルを毎分約 10 度温めます。これは、均質化中のビーズの摩擦衝突によるものです。ビーズビーティング中またはビーティング後にサンプルを冷却することは、酵素などの熱に弱いタンパク質の損傷を防ぐために必要な場合があります。サンプルの加温は、各間隔の間に氷で冷却しながら短時間のビーズビーティングを行うこと、事前に冷却したアルミニウム バイアルホルダーでバイアルを処理すること、またはビーズビーティング中にマシンに ガス状冷却剤を循環させることによって制御できます。

より大きなサンプル量に適した別のビーズビーター構成では、15、50、または 200 ml のチャンバー内で回転するフルオロカーボンローターを使用してビーズを撹拌します。この構成では、チャンバーを静的冷却ジャケットで囲むことができます。この同じローター/チャンバー構成を使用して、数リットルの細胞懸濁液を処理できる大型の市販機械が利用できます。現在、これらの機械は、酵母、藻類、細菌などの単細胞生物の処理に限定されています。

動物の結合組織、一部の腫瘍生検サンプル、静脈組織、軟骨、種子など、強固な細胞外マトリックスを持つサンプルは、液体窒素温度で衝撃粉砕することにより微粉末になります。この技術はクライオ粉砕と呼ばれ、かなりの量の水を含む生物学的サンプルは極低温では脆くなるという事実に基づいています。この技術は、1975 年に Smucker と Pfister によって初めて説明され、彼らはこの技術をクライオ衝撃と呼びました。著者らは、この方法によって細胞が効果的に破壊されることを実証し、位相差顕微鏡と電子顕微鏡によって破壊面が細胞壁と細胞質膜を横切ることを確認しました。^[4]

この技術は、液体窒素温度に冷却した乳鉢と乳棒を使用して行うことができますが、この従来の装置の使用は手間がかかり、サンプルの損失が懸念されることがよくあります。一般に組織粉砕機と呼ばれる特殊なステンレス製粉砕機も、この目的に使用できます。これらの粉砕機は手作業が少なく、サンプルの回収率が高く、サンプル間の洗浄も簡単です。この技術の利点は、特に上記の機械的または化学的/溶媒による細胞破壊方法の予備段階として使用すると、小さくて硬い組織サンプルからタンパク質と核酸をより多く得られることです。

1940年代から高圧は細胞破壊の方法として使用されてきましたが、最も有名なのはフレンチプレッシャーセルプレス、略してフレンチプレスです。この方法はチャールズ・ステイシー・フレンチによって開発され、高圧を利用して細胞を狭い開口部に押し込み、圧力差によるせん断力で細胞を溶解させます。^{[5] [6]} フレンチプレスは多くの微生物学研究室で定番のアイテムになりましたが、その生産は大部分が中止されたため、同様の技術の代替用途が復活しました。

現代の物理的細胞破砕機は、通常、空気圧または油圧によって作動します。空気圧式の機械は通常低コストですが、エアポンプのストローク全体にわたって処理圧力が変化するため、性能が信頼できない場合があります。一般的に、油圧式の機械は、ピストンのストローク全体にわたって一定の圧力を維持できるため、特に酵母やグラム陽性細菌などの破壊しにくいサンプルを処理する場合に、優れた溶解能力を発揮すると考えられています。油圧で作動するフレンチプレスは、最も一般的な細胞タイプの90%以上を溶解できるため、溶解性能のゴールドスタンダードと見なされることが多く、現代の機械は、溶解効率だけでなく、安全性や使いやすさの面でもフレンチプレスと比較されることがよくあります。一部のメーカーは、サンプルをオリフィスに通す圧力以外のこれらの機械内の特性を変更することで、従来の設計を改良しようとしています。その一例がコンスタントシステムズで、同社は最近、自社のセルディスラプターが従来のフレンチプレスの性能に匹敵するだけでなく、はるかに低い電力で同じ結果を達成することを目指していることを示しました。^[7]

圧力サイクリング技術 (PCT)。PCT は、特許取得済みの技術プラットフォームであり、常圧と超高圧 (最大 90,000 psi) の静水圧を交互に繰り返して、生体サンプル内の分子の作用 (ヒト、動物、植物、微生物由来の細胞や組織の破裂 (溶解)、病原体の不活性化など) を安全かつ便利に再現可能に制御します。PCT 強化システム (機器および消耗品) は、生体サンプルの準備に固有のいくつかの困難な問題に対処します。PCT の利点には、(a) より多くの膜タンパク質の抽出と回収、(b) タンパク質消化の強化、(c) 混合サンプルベースでの差別的溶解、(d) 病原体の不活性化、(e) DNA 検出の向上、(f) 精巧なサンプル準備プロセス制御などがあります。^[8]

細胞破壊に使用されるマイクロフルイダイザー法は、溶解した細胞懸濁液の粒子サイズ、粘度、タンパク質収量、酵素活性などの物理化学的特性に強く影響します。近年、マイクロフルイダイザー法は、その使いやすさとさまざまな種類の細胞を効率的に破壊できることから、細胞破壊で人気が高まっています。マイクロフルイダイザー技術は、Arthur D. Littleという会社からライセンスを受け、1980年代に初めて開発され、利用されました。当初はリポソーム作成ツールとして始まりました。それ以来、細胞破壊ナノエマルジョンや固体粒子サイズの縮小など、他の 用途にも使用されています。

固定形状のマイクロチャネルと増圧ポンプを使用することで、細胞を破壊する高いせん断速度が生成されます。この細胞溶解法では、大腸菌細胞の90%以上を破壊することができます。 ^[9]

多くのタンパク質は温度に非常に敏感で、多くの場合、わずか 4 度の温度で変性し始めます。マイクロチャネル内の温度は 4 度を超えますが、機械は急速に冷却するように設計されているため、細胞が高温にさらされる時間は非常に短くなります (滞留時間25 ミリ秒～40 ミリ秒)。この効果的な温度制御により、マイクロフルイダイザーは、タンパク質が温度に敏感な場合、他の機械的方法よりも高いレベルの活性タンパク質と酵素を生成します。^[10]

細胞を破砕する際には粘度の変化もよく観察されます。細胞懸濁液の粘度が高いと、ろ過や正確なピペッティングなどの下流の処理が非常に困難になる可能性があります。マイクロフルイダイザーで観察される粘度の変化は比較的低く、機械をさらに通過させると減少します。^[11]

他の機械的破壊方法とは対照的に、マイクロフルイダイザーは細胞膜を効率的かつ穏やかに破壊し、比較的大きな細胞壁断片（450 nm）を生成するため、細胞内容物の分離が容易になります。これにより、濾過時間が短縮され、遠心分離の分離が向上します。^[12]

マイクロフルイダイザー技術は、1 ミリリットルから数千リットルまで対応します。

窒素減圧では、まず、適切な圧力容器内で高圧下のセルに大量の窒素を溶解します。次に、ガス圧が突然解放されると、窒素は膨張した泡として溶液から放出され、各セルの膜を引き伸ばして破裂させ、セルの内容物を放出します。

窒素減圧法は、超音波法や機械的均質化法よりも酵素や細胞小器官を保護する効果が高く、PTFEやガラス製の乳鉢と乳棒を使用したホモジナイザーで得られる制御された破壊作用に匹敵します。 ^[13]他の破壊法は摩擦や機械的せん断作用によって熱を発生させますが、窒素減圧法では断熱膨張が伴い、サンプルを加熱するのではなく冷却します。

細胞懸濁液とホモジネートを飽和させる不活性窒素ガスの層は、細胞成分の酸化を防ぎます。この技術では二酸化炭素、亜酸化窒素、一酸化炭素、圧縮空気などの他のガスも使用されていますが、窒素は非反応性であり、懸濁媒体の pH を変えないため、好まれています。また、窒素は一般的に低コストで入手でき、この手順に適した圧力で入手できるため、好まれています。

細胞内物質は、一度放出されると、サンプルを変性させたり、望ましくない損傷を生じさせたりする可能性のある継続的な摩耗にさらされることはありません。酵素活性と破壊率のピークを監視する必要はありません。各細胞内で窒素気泡が生成されるため、サンプル全体に均一に同じ破壊力が適用され、製品の並外れた均一性が保証されます。細胞を含まないホモゲネートを生成できます。

この技術は、細胞や組織を均質化し、細胞小器官をそのまま放出し、細胞膜を準備し、不安定な生化学物質を放出し、サンプルに極端な化学的または物理的ストレスを与えることなく均一で再現性のあるホモゲネートを生成するために使用されます。

この方法は、哺乳類やその他の膜結合細胞の処理に特に適しています。 ^{[14]また、}植物細胞の処理、受精卵からのウイルスの放出、脆弱な細菌の処理にも効果的に使用されています。未処理の細菌細胞には推奨されません。酵母、真菌、胞子、その他の強固な細胞壁を持つ物質は、この方法にあまり反応しません。

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