コンティグ

コンティグ（ contiguousから）は、 DNAのコンセンサス領域を表す、重なり合うDNAセグメントのセットです。^[1]ボトムアップシーケンスプロジェクトでは、コンティグは重なり合うシーケンスデータ（リード）を指します。^[2]トップダウンシーケンスプロジェクトでは、コンティグはシーケンスとアセンブリをガイドするために使用されるゲノムの物理マップを形成する重なり合うクローンを指します。^[3]したがって、コンティグは、コンテキストに応じて、重なり合うDNA配列とクローンに含まれる重なり合う物理セグメント（フラグメント）の両方を指す場合があります。

コンティグの本来の定義

1980 年に Staden ^[4]は次のように書いています。ショットガン法によるシーケンシングで得られたデータについて説明しやすくするために、私たちは「コンティグ」という言葉を考案しました。コンティグとは、配列の重なりによって互いに関連しているゲル読み取り値の集合です。すべてのゲル読み取り値は 1 つのコンティグのみに属し、各コンティグには少なくとも 1 つのゲル読み取り値が含まれます。コンティグ内のゲル読み取り値を合計すると、連続したコンセンサス配列が形成され、この配列の長さがコンティグの長さになります。

シーケンスコンティグ

シーケンスコンティグは、ボトムアップシーケンシング戦略によって生成された小さな DNA フラグメントの再構成から生じる連続した (隣接していない) シーケンスです。このコンティグの意味は、Rodger Staden (1979) による元の定義と一致しています。 ^[5]ボトムアップDNA シーケンシング戦略では、ゲノム DNA を多数の小さなフラグメント (「ボトム」) に切り分け、これらのフラグメントをシーケンシングし、それらをコンティグに再組み立てして最終的にゲノム全体 (「アップ」) にします。現在の技術では、比較的短い DNA フラグメント (300～1000 ヌクレオチド) のみを直接シーケンシングできるため、ゲノム DNA はシーケンシングの前に小さな断片に断片化する必要があります。^[6]ボトムアップシーケンシングプロジェクトでは、増幅されたDNA はシーケンシングに適したサイズのフラグメントにランダムに切り分けられます。その後のシーケンスリード (小さなフラグメントのシーケンスを含むデータ) は、データベースに格納されます。次に、アセンブリソフトウェア^[6]は、このデータベースで重複するリードのペアを検索します。このようなペアからのリード（もちろん、同一配列のコピーは1つだけ）をアセンブリすると、配列されたDNAのより長い連続リード（コンティグ）が生成されます。このプロセスを何度も繰り返すことで、最初は最初の短いリードペアを使用し、その後、以前のアセンブリの結果であるリードペアを徐々に長くすることで、染色体全体のDNA配列を決定できます。

現在では、一貫したサイズの長い DNA 断片の両端をシーケンスするペアエンドシーケンス技術を使用するのが一般的です。ここでも、コンティグは読み取りの重複によって作成されたシーケンスデータの連続した部分を指します。断片の長さは既知であるため、各断片の 2 つのエンドリード間の距離は既知です。^{[7]これにより、これらの読み取りから構築されたコンティグの方向に関する追加情報が得られ、}スキャフォールディングと呼ばれるプロセスでコンティグをスキャフォールドに組み立てることができます。

スキャフォールドは、既知の長さのギャップで区切られた重なり合ったコンティグで構成されています。コンティグの方向に課された新しい制約により、ゲノム内での高度に反復された配列の配置が可能になります。片方のエンドリードに反復配列がある場合、そのメイトペアがコンティグ内に位置する限り、その配置は既知です。^[7]スキャフォールド内のコンティグ間の残りのギャップは、PCR増幅後にシーケンシング（小さなギャップの場合）やBACクローニング法後にシーケンシング（大きなギャップの場合）など、さまざまな方法でシーケンシングできます。^[2]

BACコンティグ

コンティグは、トップダウンまたは階層的シーケンシング戦略が使用されるときに、染色体の物理マップを形成する重複クローンを指すこともあります。 ^[1] このシーケンシング方法では、低解像度のマップがシーケンシングの前に作成され、ゲノムのシーケンスリードの後のアセンブリをガイドするフレームワークを提供します。このマップは、シーケンシングに使用されるクローンの相対的な位置と重複を識別します。連続した DNA ストレッチを形成する重複クローンのセットはコンティグと呼ばれます。染色体全体をカバーするコンティグを形成する最小数のクローンが、シーケンシングに使用されるタイリングパスを構成します。タイリングパスが選択されると、そのコンポーネント BAC は小さなフラグメントに切断され、シーケンシングされます。したがって、コンティグは階層的シーケンシングのフレームワークを提供します。^[3]

コンティグマップの組み立てには、いくつかのステップがあります。まず、DNA をより大きな断片 (50～200kb) に切断し、BACまたはPACにクローン化してBACライブラリを形成します。これらのクローンによってゲノム/染色体全体がカバーされるため、理論的には染色体全体をカバーする BAC のコンティグを組み立てることが可能です。^[1]ただし、現実は常に理想的であるとは限りません。ギャップが残ることが多く、コンティグとギャップで構成されるマップ領域をカバーするスキャフォールドが最初の結果になることがよくあります。^[1]コンティグ間のギャップは、以下に概説するさまざまな方法で埋めることができます。

BACコンティグの構築

BAC コンティグは、さまざまな方法で既知の重複のある BAC 領域をアラインメントすることによって構築されます。一般的な戦略の 1 つは、シーケンスタグサイト(STS) コンテンツマッピングを使用して、BAC 間で共通する固有の DNA サイトを検出することです。重複の程度は、2 つのクローン間で共通する STS マーカーの数によって大まかに推定され、共通するマーカーが多いほど重複が大きいことを意味します。^[2]この戦略では重複を非常に大まかにしか推定できないため、クローンの重複をより正確に測定できる制限酵素消化フラグメント分析がよく使用されます。 ^{[2]この戦略では、クローンを 1 つまたは 2 つの}制限酵素で処理し、結果として得られたフラグメントをゲル電気泳動によって分離します。2 つのクローンの場合、制限酵素部位が共通している可能性が高く、そのためいくつかのフラグメントを共有します。^[3] 共通のフラグメントの数とこれらのフラグメントの長さは既知であるため (長さはサイズ標準との比較によって判断されます)、重複の程度を高精度で推測できます。