フランクフルト高分子複合体エクセレンスクラスター

フランクフルト・エクセレンス・クラスター「高分子複合体」（CEF）は、2006年にフランクフルト・ゲーテ大学がマックス・プランク生物物理学研究所およびマックス・プランク脳研究所と共同で、ドイツ大学エクセレンス・イニシアチブの一環として設立されました。 2019年10月にドイツ研究振興協会（DFG）から資金提供を受けました。CEFは、膜タンパク質とRNA分子に関する長年の共同研究から発展し、フランクフルト・アム・マインの科学者をさらに募集することで、これらの分野の研究活動を強化しました。CEFは、フランクフルト・アム・マインのリートベルク・キャンパスを拠点とする最大45の研究グループの研究活動を統合しました。CEFは、ブッフマン分子生命科学研究所（BMLS）を設立しました。

CEF の科学者たちは、特に膜タンパク質とその集合体、シグナル伝達と品質管理に関与する複合体、および RNA タンパク質複合体などの大きな高分子複合体の構造と機能の調査に着手しました。

CEFでは、高分子複合体の重要な構造が決定されました。重要な膜複合体の例には、複合体Iの原子構造、ミトコンドリア呼吸鎖のATP合成酵素、抗原処理に関連するトランスポーター（TAP）などがあります。RNAの構造と機能の研究により、温度感知リボスイッチの制御原理、 RNAポリメラーゼIの構造と機能の関係、マイクロRNAの機能、リボソームの生合成とリサイクル中のrRNA成熟と下流プロセスのメカニズムが定義されました。たとえば、CEFの科学者は、プロテアソーム上のユビキチン鎖の受容体を特定し、線状ユビキチン鎖の役割を解明し、マイトファジー、ゼノファジー、ERファジーを制御する高分子について説明しました。彼らは、リボソームの品質管理におけるSUMO化の役割を詳しく説明し、卵母細胞における遺伝子の品質管理のプロセスを特徴づけました。これら 3 つの研究分野における取り組みには、高分子複合体の設計または再プログラム化へのアプローチと、すでに強力な専門知識を拡大するために開発された新しい方法が伴いました。CEF の科学者は、光遺伝学の原理と光制御の生化学的方法を確立し、発展させました。また、高分子の構造的および機能的特性評価のための生物物理学的手法も開発しました。例としては、細胞内アプリケーション用に設計された光スイッチング分子や、RNA フォールディングを研究するための時間分解手法などがあります。発達の観察用の光シート蛍光顕微鏡と膜複合体の分析用の LILBID質量分析法が改良されました。PELDOR-EPR は、細胞内測定を可能にする解像度に開発されました。クラスターは、さまざまなプログラム、ワークショップ、国際会議、講演シリーズを通じて科学交流を促進しました。光遺伝学と光シート蛍光顕微鏡は、それぞれ 2010 年と 2014 年に、学際研究ジャーナルNature Methodsによって科学と工学のすべての分野にわたる「今年の方法」に選ばれました。^{[1] [2]}

CEF の 5 つの研究分野には、(A) 膜内の複合体の構造、メカニズム、ダイナミクス、(B) 品質管理とシグナル伝達における高分子複合体の構成とダイナミクス、(C) リボ核酸タンパク質複合体のダイナミクス、(D) 高分子複合体の設計、および (E) 高分子複合体の研究方法が含まれます。

生体膜は生命活動において非常に重要な役割を果たします。細胞が生き、成長し、反応するために必要なものはすべて、膜を通過するか、膜に作用する必要があるからです。細胞呼吸と光合成のエネルギー変換プロセスは膜で行われ、すべての感覚刺激と脳の情報処理は膜によって仲介されます。この多様な動作の配列は、多数の異なる膜タンパク質によって実行されます。細胞膜の混雑した状態では、ほとんどの膜タンパク質が複雑で動的なアセンブリに会合して、さまざまなタスクを実行します。このため、および膜の脂質二重層に埋め込まれているため、ほとんどの膜タンパク質は研究が難しく、その機能はしばしば手に負えませんでした。 CEFの科学者は、これらの課題のいくつかを克服するための画期的な研究を行い、呼吸複合体I、^{[3] [4]} 回転ATPase、^{[5] [6] [7] [8]}スーパー複合体I ₁ III ₂ IV ₁、^{[9] [10]}シトクロムcbb3酸化酵素、^[11] シトクロムbd酸化酵素、^[12]硫化物：キノン酸化還元酵素、^[13] 真菌TOMコア複合体、^[14] 細菌の二重孔K +取り込みシステムKtrAB、^[15] Na +非依存性カルニチン/ブチロベタインアンチポーターCaiT、^[16]ベタイン/Na +共輸送体BetP、^[17] 多剤排出トランスポーターAcrB ^{[18] [19]} シャペロンと編集を含む、多くの重要な大型複合体の構造、メカニズム、および制御の解明に大きく貢献しました。 TAPBPR–MHC I複合体^[20] とヒトMHC-Iペプチドローディング複合体^[21] 。TAP 上の抗原ペプチド認識は、DNP増強固体NMR分光法によって解明されました。^[22]ヒト抗原トランスポーター相同遺伝子TmrABにおける立体配座結合とトランス阻害は、双極子EPR分光法の助けを借りて解明されました。^[23] X線結晶構造解析 による膜タンパク質の3D構造決定の進歩クライオ電子顕微鏡の登場により、磁気共鳴法による詳細なメカニズム研究の需要と機会が高まっています。膜タンパク質に固有の課題のため、進歩は方法開発の最先端技術の利用可能性に依存しています。特に固体 (MAS) NMR は、二重層環境内で膜タンパク質を直接調べることで、「静的」構造と生化学データの間のギャップを埋めることができます。このような実験は困難であり、感度向上のための動的核分極とスペクトル分解能のための非常に高い磁場の利用可能性のおかげでのみ、ブレークスルーを達成できました。CEF の科学者は、ABC トランスポーターの触媒メカニズムに関する新しい洞察を提供できました。リアルタイム 31P-MAS-NMR に基づいて、彼らはホモ二量体脂質 AフリッパーゼMsbA が ATP 加水分解に加えて、逆アデニル酸キナーゼのような反応を触媒できることを発見しました。^[24] さらに、ABCトランスポーターLmrAのATP加水分解サイクルは、部位特異的スピン標識とパルス電子-電子二重共鳴（PELDOR/DEER）分光法によって調べられました。^[25]大腸菌 からの二次多剤排出ポンプEmrEは、31PおよびDNP増強固体NMRによって広範囲に研究されました。^{[26]また、}微生物ロドプシンなど の多くの光受容体が膜貫通輸送プロセスに関与しています。たとえば、CEF内のグループは、五量体光駆動型プロトンポンプであるプロテオロドプシンの構造と機能の記述に基本的な貢献をしました。^{[27] [28] [29] CEFの研究者は、大きな膜タンパク質複合体に特に適した}質量分析アプローチを 開発しました。レーザー誘起液体ビーム/ビーズイオン脱離質量分析（LILBID）は、1 MDa以上の膜タンパク質複合体全体の質量分析を可能にします。^[30] CEFの科学者チームは、 DNP強化固体核磁気共鳴と高度な分子モデリングおよびドッキングを統合することで、ペプチドアゴニストに対するヒトブラジキニン受容体のサブタイプ選択性のメカニズムを解明しました^[31]

細胞の品質管理プログラムを制御するシグナル伝達複合体の機能と構造構成の特徴づけは、CEF 研究の主要なテーマの 1 つでした。タンパク質が単一の実体として機能するという見方は、シグナルソームとして注釈が付けられた多量体可溶性複合体の動的な再編成が細胞内のシグナル伝達に不可欠であることを示唆する概念に取って代わられました。これらの複合体の活動の調節は、タンパク質の翻訳後修飾(PTM) だけでなく、それらの動的構成によっても達成されます。これらの修飾を認識するドメインは、細胞が微小環境の変化に応答する能力において決定的な役割を果たします。CEF は、ユビキチン化、リン酸化、アセチル化などの PTM によるいくつかのシグナル伝達経路とその調節の特徴づけにおいて大きな進歩を遂げました。 CEF における研究の特に重点は、欠陥のある、または余分なタンパク質、複合体、および細胞小器官を分解するために使用される 2 つの細胞システムであるオートファジーおよびユビキチン/プロテアソーム経路の基礎となるタンパク質品質管理メカニズムに置かれています。CEF 研究のその他の焦点は、p53タンパク質による卵母細胞および上皮幹細胞の遺伝子品質管理と、キナーゼによるおよびの調節でした。

選択的オートファジーでは、カーゴが特異的に分解の標的となり、選択性を調節する個別のカーゴ受容体が報告されている。このプロセスは、オートファジー受容体がカーゴを特異的に認識して結合し、それをファゴフォアに届けることで促進される。ヒトでは、6つの異なるLC3/ GABARAPタンパク質が存在し、これらは新生オートファゴソーム膜とカーゴを積んだオートファジー受容体を結合して貪食を促進する中心的な役割を果たしており、追加のアダプタータンパク質によって媒介またはサポートされることもある。 ^[32] CEFの科学者らは、GABARAPタンパク質がオートファジーだけでなく、ユビキチン依存性のTIAM1分解にも関与していることを示した。^[33] 細胞が細胞内病原体と戦う仕組みと、細胞内細菌がこれらの対抗手段を回避する仕組みについて、画期的な進歩が達成された。キナーゼTbk1は、感染細胞から細菌を除去するためのオプティニューリンベースの異種食作用を媒介する上で重要であることが特定された。 ^{[34]質量分析法を用いて}サルモネラ菌に感染した細胞 のユビキチン分子の包括的な解析が行われ、CEFの科学者らは病原菌によって細胞質に分泌される細菌リガーゼの特定の標的を特定することができた。 ^{[35] CEFの科学者らはまた、病原菌}レジオネラ菌のエフェクターSdeAによる 新しいタイプのホスホリボシル結合セリンユビキチン化の分子メカニズムを明らかにした。これは標準的なリジンベースのユビキチン化メカニズムとは非常に異なる。^{[36] [37]彼らはさらに、}レジオネラ菌 の別のエフェクターであるSidJが酵母細胞および哺乳類細胞におけるSidEの毒性に対抗することを示した。^[38] 質量分析の結果、SidJはSdeAのモノADPリボシルトランスフェラーゼドメインの触媒グルタミン酸を修飾し、SdeAのユビキチンリガーゼ活性を阻害するグルタミラーゼであることが明らかになりました。さらに、レティキュロン型タンパク質がER特異的オートファジー受容体として作用することを発見し、膜曲率への影響をシミュレートしました。^{[39] [40]}

ユビキチン化は、オートファジー経路またはプロテアソームを介して分解されるタンパク質をマークする中心的な役割を果たします。CEFのいくつかのグループは、ユビキチンシグナル伝達が分解シグナルとしてだけでなく、他のいくつかの細胞プロセスにも関与していることを理解するための進歩に貢献しました^{[41] [42] [43] [44] [45] [46]}

p63としても知られるTP63に関する研究では、このタンパク質が重層上皮組織の増殖と分化、および雌性生殖細胞の遺伝的品質の監視の両方に重要な役割を果たすことが示されています。 CEFの科学者による調査では、p63の特定のアイソフォームが減数分裂Iの前期で停止している原始卵母細胞で高度に発現していることが示されました。 このアイソフォームは、DNAとの相互作用と転写機構との相互作用の両方が大幅に減少した、閉じた不活性な二量体構造を採用しています^[47] 阻害は、6本鎖の逆平行βシートでオリゴマー化ドメインの四量体化インターフェースをブロックすることによって達成されます。^[48] 活性化にはリン酸化が必要であり、バネ仕掛けの不可逆的な活性化メカニズムに従います。^[49] これらの発見は、女性の癌患者では通常不妊症や閉経の早期発症につながる化学療法中に卵母細胞を保存する治療法の開発の可能性を開く。CEFの科学者はまた、皮膚のびらん、口腔裂異常、眼瞼癒合を特徴とする疾患である眼瞼癒着外胚葉異形成口唇口蓋裂症候群を引き起こす分子メカニズムの特定にも貢献した。この疾患はSAMドメインまたはp63のC末端の変異に基づいている。^[50] 腫瘍形成に関与する複合体は、白血病誘発性AF4-MLL融合タンパク質^[51]や、アポトーシスやネクロプトーシスなどさまざまな形態の細胞死 の開始と微調整に重要なRIP1含有細胞質複合体など、 CEFのいくつかのグループによって研究された^{[52] [53]。}

ゲーテ大学は2017年に構造ゲノミクスコンソーシアム（SGC）のメンバーになりました。SGCは、重要なタンパク質の構造決定と、機能調査に使用される生物学的高分子の阻害剤とプローブの開発に特化した国際コンソーシアムおよび官民パートナーシップです。ゲーテ大学はまた、SGCの寄贈プローブプログラムの本拠地およびリファレンスセンターにもなり、このプログラムにより、産業界が薬物ターゲットとしてこれ以上追求しなくなった小分子が世界中の研究者に自由に利用できるようになります^[54]）。CEFの科学者は、これらのアセチルリジン修飾結合ドメインの機能の研究に使用できるブロモドメイン阻害剤を開発しました。一連のプローブは、特定のブロモドメインのツールとして特徴付けられ、検証されています^[55]

CEFは、血管内皮増殖因子受容体-2が内在化する必要があり、内皮細胞内のエフリンB2との結合によって制御されることを示した。 ^[56]エフリンB2は、シナプス膜のAMPA受容体 のレベルを制御するために不可欠であることもわかった。 ^[57] 尾部アンカータンパク質の膜挿入のメカニズムは、可溶性Get3タンパク質と膜結合受容体Get1およびGet2の細胞質ドメインとの相互作用の構造的および生化学的特徴付けによって研究された。^[58]

複数のクラスの非コードRNAや調節RNA要素の特定を含む多くの発見により、RNA機能に対する見方は、受動的な情報伝達者から能動的な細胞構成要素へと広がりました。その構造と機能の説明は、分子相互作用とそれに伴うダイナミクスを理解するために必要です。

高解像度NMRによるRNA構造の解析^{[59] [60]} と、異なる立体構造をケージングすることによるRNAの時間分解リガンド誘導リフォールディング^[61]、塩基特異的スピン標識後の パルス電子常磁性共鳴法（PELDOR） ^{[62] [63] [64]} 、およびRNAダイナミクスの超高速レーザー分光法^{[65] [66]}を組み合わせることで 、いくつかのRNAの構造ダイナミクスの記述が可能になりました。CEFの科学者は、ヒト病原性細菌ビブリオ・バルニフィカスのアデニン感知リボスイッチの制御機構は、3つの異なる安定した立体構造を伴うという点で、2状態スイッチ機構とは著しく異なることを示しました。この翻訳アデニン感知リボスイッチは、温度補償型制御RNA要素の最初の例を表しています。^[67] HIV TAR RNA-リガンド複合体 の構成と構造はLILBIDとNMRによって分析され、^{[68] [69]} RNA内のペプチド結合部位の複雑さの説明につながった。さらに、枯草菌xpt -pbuXオペロンのグアニン感知リボスイッチアプタマードメイン、 RNAベースの温度計であるディールスアルデラーゼリボザイム^{[70] 、 [71]} 、およびN1-リボスタマイシン複合体^[72] の構造と機能が分析された。CEFの科学者らはまた、枯草菌のグアニン感知xpt-pbuXリボスイッチの場合、全長転写産物の立体配座は静的であることを示した。つまり、リガンドの有無にかかわらず、機能オフ状態のみを占め、オン状態に切り替えることはできない。転写速度とリガンド結合の組み合わせが一致することによってのみ、転写中間体はリガンド依存的な立体構造のリフォールディングを受けることができる^[73]（Steinert et al.、2017）。

CEFの科学者はマックスプランク生物物理化学研究所と共同で、細胞環境でリボソーム遺伝子を活発に転写する過程におけるRNAポリメラーゼI（Pol I）を可視化し、クライオ電子顕微鏡法で3.8Åの解像度で核酸の有無にかかわらずその構造を解明しました。^{[74]その構造は、収縮したポリメラーゼ構造と拡張したポリメラーゼ構造がそれぞれ活性状態と不活性状態に関連付けられている}転写伸長 の調節を説明しました。

CEFの複数のグループによる共同研究により、リボソーム生成因子Nep1の疾患原因となる点変異が、その核小体局在とRNA結合を損なうことを実証し、ボーエン・コンラディ症候群の分子的性質が解明された。 ^{[75] [76]} エディンバラ大学との共同研究による別の研究では、RNAの架橋とcDNAの分析（CRAC）によってRNAヘリカーゼPrp43を分析し、リボソーム生成におけるこの酵素の機能的役割について初めて知見を提供した。^{[77] CEFの科学者らはまた、} rRNA処理に必須の機能を持つA. thaliana の植物特異的リボソーム生成因子を特定し^[78] 、60S関連リボソーム生成因子LSG1-2がA. thalianaの40S成熟に必要であることを示した。^[79]

高解像度顕微鏡を使用して、真核細胞のネイティブ環境におけるRNPの動態を視覚化し、定量化した。^[80] RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ（ADAR）酵素 によって触媒されるアデノシンからイノシン（AからI）へのRNA編集は、 RNA代謝のエピトランスクリプトーム制御に重要である。血管新生とアテローム性動脈硬化症に関連するシステインプロテアーゼをコードするカテプシンS （CTSS）mRNAは、ヒトの内皮細胞で高度に編集されていることが示された。^[81] AからIへのRNA編集は、HuRを介した転写後制御を可能にすることで、アテローム性動脈硬化症におけるカテプシンSの発現を制御する。

核から細胞質へのmRNAの輸出は、遺伝子発現において高度に制御されたステップである。CEFの科学者らは、SRタンパク質ファミリーのメンバー（SRSF1～7）が核輸出因子1（NXF1）のアダプターとして機能し、それによってpre-mRNAの処理をmRNA輸出に結びつける可能性を評価した。 ^[82] 彼らは、1000を超える内因性mRNAが、in vivoでの核輸出に個別のSRタンパク質を必要とすることを発見した。このメカニズムを解明するために、 NXF1とSRSF1～7のトランスクリプトーム全体のRNA結合プロファイルが、個別ヌクレオチド分解能UV架橋および免疫沈降（iCLIP）によって並行して決定された。SRSF3は、最後のエクソンにおけるNXF1によるRNA結合に配列特異性を付与する、最も強力なNXF1アダプターとして浮上した。多くのヒト疾患は、RNA結合タンパク質（RBP）の広範な調節不全とトランスクリプトームパターンの大幅な変化を特徴とする。 CEFの科学者たちは、 IMBマインツの研究者と共同で、計算手法を用いて転写後制御のメカニズムを転写スケールで研究した。^[83]

CEFの科学者らは、長鎖非コードRNA（lncRNA）やマイクロRNA（miRNA）などの新しい非コードRNAが細胞機能に及ぼす影響も調査した。miRNAは標的mRNAに結合してその翻訳を妨げることで遺伝子発現を調節する。CEFの重点プロジェクトの1つは、神経樹状突起における活動依存的な空間的に局在したmiRNA成熟の観察に成功した。^[84] miRNAの局所的成熟はタンパク質合成の局所的減少と関連していることが判明し、局所的なmiRNA成熟が標的遺伝子発現を局所的かつ時間的な精度で調節できることを示した。LncRNA Meg3は内皮細胞の老化を制御することが判明しており、その阻害は老化による内皮細胞機能障害を救済する潜在的な治療戦略となる可能性がある。^[85] LncRNA MALAT1は内皮細胞の機能と血管の成長を調節することが判明した。^[86]炎症を 調節することで動脈硬化を予防します。^[87]

CEF での主な研究の焦点は、光による細胞および分子の機能の調節を可能にする方法の開発と使用、およびタンパク質の探索でした。オプトジェネティクスの分野では、ニューロンやその他の細胞における膜電位と細胞内シグナル伝達の制御は、光センサータンパク質 (ほとんどの場合、イオンチャネルやポンプなど微生物由来) や光活性化酵素の発現によって実現されます。対照的に、光化学的アプローチでは、化学的に設計された分子を使用して、生物組織に光効果をもたらします。

オプトジェネティクスの起源は、フランクフルトのMPI生物物理学のバンベルクグループの研究にあります。彼らは、チャネルロドプシン2（ChR2）が光依存性カチオンチャネルであり、それが発現している細胞を脱分極できることを示しました。^{[88] [89]} CEFの間、バンベルク研究室はこの分野での研究を継続し、例えば特性評価^{[90] [91] [92]} だけでなく、さまざまな特性を持つオプトジェネティクスツールへのChR2のエンジニアリング[93]など、いくつかの独創的な論文を発表しました。哺乳類^細胞 の脱分極へのChR2の最初の利用と最初のChR2トランスジェニック動物の生成は、フランクフルトで行われました。ゴットシャルク研究室は、光駆動型塩素ポンプハロロドプシンであるChR2と他のロドプシンを線虫C. elegansの神経系に導入し、単一ニューロンを刺激してその機能を行動出力と相関させた。^{[94] [95] [96]} さらに、彼らは、電気生理学と電子顕微鏡法と組み合わせて、ChR2と光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）を使用して光刺激後のシナプス伝達を研究し、 ^{[97] [98]}シナプス伝達を 阻害するか、環状グアノシン一リン酸（cGMP）を操作するための、特性を変えた改良型または新規の光遺伝学的ツールを導入した。^{[99] [100] [101]}複数のCEFグループ が協力して、 異なる時間スケールでChR2の光サイクルを解明しただけでなく^{[102] 、 [103]} 彼らはまた、イオン伝導性（例えば、Ca ²⁺輸送チャネルロドプシンである「CatCh」のCa ²⁺透過性の増加）や速度論が変化したいくつかの変異ChR2バージョンを生成し、オプトジェネティクスツールボックスに非常に有用な追加機能を提供しました。^[104] 2015年に、CEFの科学者は、ChR2の網膜補因子の構造詳細を解明した最初のNMR研究を発表しました。この研究は、 DNP （ EPRと固体NMR分光法をリンクしたハイブリッド法）のおかげで可能になりました。）は検出感度を60倍に高め、準安定中間体の検出を可能にした。このようにして、暗状態での網膜の全トランス立体配座に関する最初の明白な証拠が提供され、新しい光中間体が特定された。この研究は、DNP増強固体NMRが、X線ベースの構造解析と機能研究の間のギャップを埋め、高解像度の分子像を得るための重要な方法であることを示した。^[105]

ロドプシンは幅広い機能と分布を持ち、すべての門の生命に見られることが徐々に明らかになりました。新しいロドプシンでは、保存されたリジンに結合した網膜発色団を持つ7つの膜貫通ヘリックスの構造的足場を保持しながら、かなり用途の広いタンパク質ファミリーを表しているという観察が行われました。^[106] CEFの科学者は、微生物ロドプシンの構造と機能を研究しました。これらの1つは、海洋微生物に見られるプロテオロドプシンで、地球上で最も豊富な網膜ベースの光受容体です。プロテオロドプシンのバリアントは、色が利用可能な光の最適な波長に調整されているため、高度な環境適応を示します。^{[107] [108] [109] [110] [111]}

CEFの科学者たちは、ドイツの他の大学の同僚たちと共同で、網膜発色団の改変によってロドプシン光遺伝学的ツールの機能特性を変えるための新しいアプローチを開発した。合成網膜類似体がC.エレガンス、ショウジョウバエ、ヒト細胞のChR2または他のロドプシンツールに導入され、光遺伝学的アクチュエータの光感度、光サイクル速度論、および色スペクトルが変更された。^[112] 彼らはまた、光によって厳密に制御されるグアニル酸シクラーゼオプシンCyclOpを確立し、光誘発性cGMPの急速な増加を可能にした。^{[113] CEFの科学者たちはまた、}神経回路とそれが行動を駆動する仕組み の分析に光遺伝学的ツールを使用している。^{[114] [115] [116]}

CEF の科学者は、タンパク質や核酸を光で制御するために、さまざまな光スイッチ可能なテザー、リボヌクレオシド、核酸、RNA アプタマー、および「ビーコン」を設計して適用してきました。^{[117] [118] [119] [120] [121]}また、光制御を含む生物物理学的研究のために、位置特異的に修飾された RNA の化学酵素合成 のアプローチも開発しました。 ^[122] さらに、DNA ナノアーキテクチャの光活性化相互作用、核酸の光依存性構造変化、光依存性RNA 干渉、および光依存性転写が実現しました。^{[123] [124]} 核酸の波長選択的光トリガーが確立され^{[125] 、}直交2 色 2 光子アンケージングによるDNA ハイブリダイゼーション の 3 次元制御も確立されました。 ^[126] CEF の科学者は、3 次元光放出用の赤方偏移 2 光子のみのケージング グループを開発しました。^[127] 彼らはまた、光で切り替え可能な最小限のモジュールを開発し、光で切り替え可能なアゾベンゼン残基を骨格構造の一部として持つ、分子間および立体構造的に明確に定義された DNA G 四重鎖構造の形成を可能にしました。 ^{[128]また、神経}樹状突起における活動依存的に空間的に局在した miRNA 成熟の検出を可能にした誘導性蛍光プローブ の開発も重要でした。^[129] CEF の科学者たちは、 光誘導性抗 miRを使用して、局所的に制限された標的miRNA の活動が糖尿病性創傷治癒に治療上の利点があるかどうかも調査し、光を使用して治療活性抗 miR を生体内で局所的に活性化できることを発見しました。^[130]

CEFでは、 DNAナノアーキテクチャの新しい構築原理が確立されました^{[131] [132] [133]} また、小さな代謝物、外因性分子、または温度変化によってトリガーできる新しいRNAリボスイッチ、および生体内での遺伝子発現を制御するために使用できるアプタマーまたは自己切断リボザイムが設計されました。^[134] 高分子をナノスケールで操作しやすくするために、CEFは、非常に高い精度で2次元で高分子複合体を編成するための一般に適用可能な方法、および生体分子の相互作用と高分子複合体の組み立てを制御するための小さな合成ゲートキーパーと新しい「光スイッチ」を開発しました^{[135] [136] [137] [138] [139]} 2光子活性化によって3次元タンパク質ネットワークを組み立てる方法が開発されました。^[140] CEFの科学者らはまた、合成光条件付きウイルス阻害剤を用いて抗原転座 の光学的制御を達成した。 ^[141]

CEFの科学者らは、脂肪酸合成酵素（FAS）メガコンプレックスの詳細な構造知識を活用し、in vitroとin silicoの手法を組み合わせて、短鎖脂肪酸とポリケチドの生合成用にFASを設計した。^{[142]彼らは}サッカロミセス・セレビシエ のFASの鎖長制御を再プログラムし、短鎖脂肪酸を生成できるパン酵母を作成した。FASの分子メカニズムを変更せずに、合理的で侵襲性の低いタンパク質工学手法を使用し、パン酵母が短鎖脂肪酸を生成できるようにする5つの変異を特定した。^[143] タンパク質の光サイクルを指向的に操作するために、CEFグループは協力して、フラボタンパク質ドデシンの主要アミノ酸トリプトファンを、構造的および電子的影響を考慮して慎重に選択した置換基で改変した。 [ 144 ^]

電子常磁性共鳴（EPR）、時間分解核磁気共鳴分光法（NMR）、先進蛍光顕微鏡法、光遺伝学、光化学生物学などの最先端の方法論の開発は、CEFの研究活動に大きく貢献しています。また、このクラスターは、電子顕微鏡法やトモグラフィー、超解像顕微鏡法における新たな開発成果を、リートベルク キャンパスの方法論ポートフォリオに統合しました。

クライオ電子顕微鏡法は、2015年のネイチャーメソッドオブザイヤー^[145]に選ばれ、2017年にノーベル賞を受賞した方法^{[146]であり、} MPIオブバイオ物理学やゲーテ大学ブッフマン分子生物学研究所のいくつかのCEFグループによって広範に採用されました。^{[147] [148] [149] [150] [151]} MPIオブバイオ物理学が開発に関わった直接電子検出器は、すべての期待を超えました^{[152] [153]これらの検出器を使用すると、以前に使用された}CCDカメラ よりもはるかに高いコントラストで画像を撮影でき、構造生物学に驚くべき進歩をもたらしました。この新しい技術に投資することで、CEFメンバーは構造決定をスピードアップし、 X線結晶構造解析研究に適さなかった高分子複合体の構造を解明することができました。 CEFの電子顕微鏡学者のもう一つの焦点は、クライオ電子トモグラフィーによって生きた細胞の高分子構造を明らかにすることであった。クライオ電子トモグラフィーは、準自然環境にある無傷の細胞の分子解像度画像を取得できる唯一の技術である。このようなトモグラムは本質的に細胞プロテオームの3次元マップであり、高分子相互作用のネットワーク全体を描写するため、大量の情報が含まれている。情報マイニングアルゴリズムは、さまざまな技術からの構造データを活用し、個別の高分子を識別し、細胞トモグラムの原子解像度構造を計算的に適合させ、それによって解像度のギャップを埋める。^[154]

クラスターは、高度な光学顕微鏡法の新たな開発も強力に支援している。フランクフルトの研究技術ポートフォリオにCEFが追加した特に重要な技術は、光シート蛍光顕微鏡法（LSFM）^{[155] [156]}）。LSFMでは、励起プロセスにおける光学的セクショニングにより、蛍光体の退色と光毒性の影響が最小限に抑えられる。LSFMを使用すると、生物標本は長期間にわたって高い時空間解像度で3次元イメージングに耐えられるため、このような顕微鏡は発生生物学で選択されるツールとなっている。LSFMの影響は2015年に認められ、Nature Methods誌が「2014年最優秀手法」に選出した。^[157] CEFの科学者は、たとえばLSFMを使用して、進化的に無関係なさまざまな昆虫の完全な胚発生を詳細に画像化し、胚発生後の植物器官の細胞分裂パターンのルールと自己組織化特性を確立した。^{[158] [159] [160]} 高度な光学顕微鏡によって生成される大量のデータにより、自動画像分析が不可欠となり、CEFは高度な光学顕微鏡データのデータ処理とモデリングの改善に貢献しました。^{[161] [162]} CEFの科学者が使用するその他の新しい光学顕微鏡技術には、細胞内の生体分子の構造組織を研究するために単一分子感度と回折限界未満の空間分解能を提供する技術が含まれます。 CEFの科学者が開発したソフトウェアツールには、たとえばハイデルベルグ大学と共同で開発されたソフトウェアであるSuReSimがあり、グラウンドトゥルースモデルによって表される任意の3次元構造の局在データをシミュレートし、ユーザーが実験パラメータを変更すると潜在的な画像化結果にどのように影響するかを体系的に調査できるようにします。^[163] 新しく開発された技術を使用して、CEFの科学者は、細胞質病原体サルモネラチフス菌の周りの線状ユビキチンコートが局所的なNF-κBシグナル伝達プラットフォームとしての役割を確立し、細菌病原性におけるNF-κB活性化におけるOTULINの機能についての洞察を提供しました。^[164] もう1つの例は、ER管の分解に対する特異的受容体としてのレチキュロン3 （RTN3）の特定です。^[165] コンソーシアムの緊密な協力チームワークにより、生細胞および単一分子局在顕微鏡法における2つの大きな課題、すなわち細胞膜を介した蛍光体の効率的な送達と超小型ラベルによる高密度タンパク質追跡に取り組むことができました。^{[166] [167]}総合的に、新しいツールは、細胞タンパク質を特異的に操作および捕捉するための追加の手段を提供し、同時に、単一分子ベースの顕微鏡による高解像度の読み取りを可能にします。

CEFでは、生物学用途の幅広い分光法が利用可能であり、CEFの科学者は生体分子NMRおよびEPRのさらなる開発において大きな進歩を遂げました。生体分子磁気共鳴センター（BMRZ）のメンバーは、動的核分極（DNP）を備えた分光計によって液体および固体NMRの感度を改善しました。ロシア科学アカデミーの研究者と共同で、CEFの科学者はDNP用の高出力ジャイロトロン源を開発しました。この源は260GHzで動作し、出力は20Wで、準光学コルゲート導波管によって1つの液体NMR分光計と1つの固体400MHz NMR分光計に接続されています。EPR信号を検出し、高出力マイクロ波源をNMRプローブに接続するマイクロ波ボードは、ウクライナ科学アカデミーの科学者との共同作業で構築されました。この独自の装置は、超低損失と機器設計の高度な柔軟性を兼ね備えた金属誘電体導波路システムをベースとしています。CEFの科学者らは、9. Tの磁場において水性液体中の陽子NMR信号が最大80倍増強されることを実証しました^[168]。 これは理論予測を20倍以上上回るものです。高分子複合体への最初の応用も同様に成功しています。彼らはまた、脂質二重層に再構成されたプロテオロドプシンを用いて、100 Kでマジックアングルサンプルスピニング（MAS）条件下で最大40倍の信号増強を記録しました。DNP増強固体NMR分光法と高度な分子モデリングおよびドッキングを統合することにより、ペプチドアゴニストに対するヒトキニンGタンパク質共役受容体のサブタイプ選択性のメカニズムが解明されました。^[169] DNP増強固体NMR分光法によって、CEFの科学者は、ヒトABCトランスポーターTAPに結合した抗原ペプチドの原子分解能バックボーン構造を決定することができました。彼らのNMRデータはまた、抗原ペプチドの側鎖とTAPとの間の相互作用の性質について比類のない洞察を提供しました。彼らの発見は、ヒトの免疫と健康におけるこのABCトランスポーターの重要な機能を定義する基質選択ルールの構造的および化学的基礎を明らかにしました。この研究は、真核生物のトランスポータータンパク質複合体の最初のNMR研究であり、この分野における固体NMRの威力を実証しました。 ^[170]彼らはまた、機能的および構造的データとモデルの間のギャップを埋めるためのDNP増強固体NMRの威力を実証しました。 ^[171] DNPの開発と並行して、6.4 Tの磁場を持つパルス電子-電子二重共鳴（PELDOR）分光計が構築されました。わずか10 pMolのタンパク質濃度で40 Kでの測定に十分です。この装置を使用して、CEFの科学者は非共有結合タンパク質複合体の二量体構造を決定することができました。この方法は、生体内の膜タンパク質やスピン標識RNAおよびDNA分子にも適用できます。^[172] PELDOR分光法は、細胞環境下でもタンパク質の構造研究に多目的に使用できるツールであることが証明されました。例えば、TAP相同遺伝子における非対称ヌクレオチド結合ドメインの構造的意味合いとトランス阻害機構を調査するために、TmrAB（ヒト抗原転座複合体TAPの機能的相同体）のヌクレオチド結合ドメインと膜貫通ドメインに二重システイン変異体を介してスピンラベルペアを導入し、コンフォメーションの変化と平衡集団をPELDOR分光法を使用して追跡しました。^[173]この研究は、外向きの状態から閉塞したコンフォメーションを介した逆遷移によって機能するトランス阻害の機構的基礎を定義しました。結果は、ABCエクスポーターの機能と制御における可逆的なコンフォメーション平衡の中心的な役割を明らかにし、刻印された非対称性を持つ他の医学的に重要なトランスポーターの将来の研究のための機構的枠組みを確立しました。この研究では、複数のドメインにおける平衡集団と、大きな膜タンパク質複合体における全体的な構造変化に対するそれらの相互依存性を解明する可能性も初めて実証されました。

ネイティブ質量分析は、構造生物学における重要なツールとして浮上している。X線結晶構造解析や核磁気共鳴などの他の方法と比較した質量分析の利点は、例えば、検出限界が低いこと、速度が速いこと、不均一なサンプルを処理できることなどである。CEFは、ゲーテ大学で開発された、特に大きな膜タンパク質複合体の分析に適した方法であるレーザー誘起液体ビーズイオン脱離質量分析（LILBID）の開発に貢献した。^{[174]ネイティブ質量分析の課題は、溶液から気相への移行中に、}オリゴマー状態、結合リガンド、またはタンパク質複合体の立体配座 など、対象タンパク質の特徴を維持することである。これは、気相測定に基づいて溶液状態のタンパク質複合体についての結論を出すための重要な前提条件である。したがって、ソフトイオン化技術が必要である。nESIやマトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）などの標準的な方法は、可溶性タンパク質に対しては確実に有益な結果をもたらしますが、膜タンパク質複合体にしばしば必要とされるより扱いにくいマトリックスには普遍的に適用できるわけではありません。一般的に、細胞環境の外で膜タンパク質複合体を天然の状態で維持するには、人工の膜を模倣した環境が必要です。^{[175] [176]} LILBIDでは、ピエゾ駆動の液滴発生器によって生成されたサンプル溶液の小さな液滴（直径30または50μm）で分析物が質量分析計に移され、中赤外レーザーの照射によって水溶液から脱着されます。これにより、nESIと比較してより低く、より天然に近い電荷状態の生体分子イオンが得られます。超ソフトな脱着条件では、大きなタンパク質複合体の弱く相互作用するサブユニットでさえも会合したままなので、複合体全体の質量を決定できます。レーザー強度が高ければ、複合体は熱分解によって解離し、サブユニットの質量が記録される。CEF研究分野A、C、Dの広範囲の高分子複合体（複合体I、ATP合成酵素、結合タンパク質を含む薬物輸送体、イオンチャネル、プロテオロドプシン、DNA/RNA複合体など）がLILBIDを使用して分析されている。^{[177] [178] [179] [180]}

CEF の科学者は、分子のダイナミクスと機能を研究するためにフェムト秒時間分解分光法を使用しました。この方法により、小さな有機化合物から複雑な酵素まで、さまざまな分子が関与する極めて高速な化学反応と生物学的反応をリアルタイムで観察できます。研究対象には、光スイッチ、天然および非天然の光合成モデル システム、膜タンパク質複合体などの分子システムが含まれます。分子物理化学における基本的なプロセス、たとえば光異性化、エネルギーと電子の移動、表面での反応ダイナミクスなどが調査されました。可視および赤外線スペクトル範囲で適切に成形され調整可能なフェムト秒パルスを生成するための量子光学の最新手法が採用され、さらに開発されました。これらの研究の例には、光応答性生体高分子の設計の基礎としての光スイッチ可能または光不安定な化合物のダイナミクス、チャネルロドプシン-2（ChR2）の一次反応ダイナミクス、抗生物質結合アプタマーの立体配座ダイナミクスの調査と解明が含まれます。フォトクロミックスピロピランは、生物学的反応を誘発するために使用できる有機分子です。^{[181] [182] [183]​​ [184] [185]}

理論生物物理学における方法開発は、高分子複合体の研究においてますます重要な役割を果たしており、CEF の他の研究分野の多くの研究に不可欠な貢献をしてきました。基礎物理学、化学、生物学の橋渡しとして、CEF の科学者は、量子力学から化学反応速度論、分子動力学 (MD) シミュレーションにおける物理プロセスと化学反応の原子論的記述から、分子機械の非平衡動作の非常に粗粒度なモデル、タンパク質相互作用のネットワーク記述まで、幅広い解像度で生体分子プロセスを研究しました。彼らの目標は、エネルギー変換、分子輸送、シグナル伝達、酵素触媒など、主要な生体分子プロセスの詳細かつ定量的な記述を開発することです。CEF 内では、彼らはさまざまな方法を採用する実験科学者と緊密に協力して作業しました。彼らの計算および理論研究は、ますます複雑化する測定の解釈に役立ち、将来の実験の設計を導きました。^{[186] [187] [188] [189] [190]} バイオインフォマティクスの学際的な分野は、分子プロセスと細胞機能に関する新たな視点を切り開きました。CEFの科学者は、タンパク質 -RNA相互作用と転写後調節に主に焦点を当て、オミックスデータの高速で効率的な分析^{[191]のためにカスタマイズされたコードとパイプラインを使用しました。 [192] [193] [194]} また、原子タンパク質構造解析から計算システム生物学に至るまで、分子生物学の問題を解決するためのアルゴリズムも開発しています。彼らのツールは、CEF内で幅広い用途を持つグラフ理論、ペトリネット、ブールネットワーク^{[195] [196]を活用しています。彼らのコラボレーションは、植物のメタボロミクス[197]}から ヒトのシグナル伝達ネットワーク^[198] 、高分子コンプレクソームの解剖まで、 多様なトピックをカバーしています。 ^{[199] [200]}

CEF総会は研究を調整し、CEF議長とCEF理事会を選出した。CEF総会は主任研究者、補助研究者、上級研究者、および関連メンバーで構成されていた。CEFの議長には、ヴェルナー・ミュラー＝エステル（2006年11月～2009年1月）、ハラルド・シュヴァルベ（2009年2月～2013年2月）、フォルカー・デッチュ（2013年3月～2019年10月）がいた。^{[201] [202]}

CEF の科学者は、クラスターの存続期間中に 2,600 件を超えるオリジナルの研究出版物 (インパクト ファクター ≥ 10 のジャーナルに掲載された 479 件の研究論文を含む) を発表しました。完全なリストは、こちらでご覧いただけます。

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