極低温電子顕微鏡

極低温電子顕微鏡法（クライオEM）は、極低温に冷却されたサンプルに適用される極低温顕微鏡法の技術です。生物標本の場合、構造はガラス質の氷の環境に包埋することで保存されます。水性サンプル溶液をグリッドメッシュに塗布し、液体エタンまたは液体エタンとプロパンの混合物にプランジ凍結します。^[1]この技術の開発は1970年代に始まりましたが、最近の検出器技術とソフトウェアアルゴリズムの進歩により、原子に近い解像度で生体分子の構造を決定できるようになりました。^[2]これにより、結晶化を必要とせずに高分子の構造を決定するためのX線結晶構造解析やNMR分光法の代替として、このアプローチが広く注目を集めています。 ^[3]

2017年、ノーベル化学賞は「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡法の開発」に対してジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンに授与されました。 ^[4]また、 ネイチャー・メソッドは2015年にクライオ電子顕微鏡を「今年の方法」に選びました。 ^[5]

1960 年代には、高エネルギー電子ビームによる放射線損傷のため、構造決定法としての透過型電子顕微鏡の使用は限られていました。科学者たちは、低温で試料を検査するとビームによる放射線損傷が軽減されるだろうと仮説を立てました。 ^[6]液体ヘリウム(-269  °Cまたは 4  Kまたは -452.2  °F ) と液体窒素(-195.79 °C または 77 K または -320 °F)はどちらも極低温物質と考えられていました。1980 年に、Erwin Knapek とJacques Dubochet は、極低温でのビーム損傷に関するコメントを発表し、次のような観察結果を共有しました。

炭素膜上に載せられた薄い結晶は、室温よりも4Kで30～300倍の耐ビーム性があることがわかりました...私たちの結果のほとんどは、4K領域での凍結保護が温度に大きく依存していると仮定することで説明できます。^[7]

しかし、これらの結果は再現性がなく、わずか 2 年後にNature 誌に修正版が掲載され、ビーム耐性は当初予想されていたほど重要ではなかったことが報告されました。4 K で得られた保護は、以前に述べられていたものよりも「L-バリンの標準サンプルの 10 倍」に近いものでした^[8]。

1981年、欧州分子生物学研究所の科学者であるアラスデア・マクドウォールとジャック・デュボシェは、クライオ電子顕微鏡法の初めての成功例を報告した。^[9]マクドウォールとデュボシェは、親水性カーボンフィルムに純水をスプレーし、急速に極低温流体（77 Kに冷却された液体プロパンまたは液体エタン）に浸すことで、薄膜状に純水をガラス化した。非晶質氷の薄い層の厚さは1 μm未満で、電子回折パターンにより非晶質/ガラス質氷の存在が確認された。1984年、デュボシェのグループは、ガラス化したアデノウイルス2型、T4バクテリオファージ、セムリキ森林ウイルス、バクテリオファージCbK、水疱性口内炎ウイルスの分析により、構造生物学におけるクライオ電子顕微鏡法の威力を実証した。^[10]

2010年代は電子カメラの劇的な進歩が顕著でした。特に、直接電子検出器 の改良により「解像度革命」^[11]が起こり、アミノ酸の位置と方向を解明するための重要な約2〜3Åの限界を下回る解像度の壁が押し上げられました。^[12]

ヘンダーソン（MRC分子生物学研究所、英国ケンブリッジ）は、ラザフォード・アップルトン研究所のエンジニアおよびマックス・プランク協会の科学者とコンソーシアムを結成し、最初のプロトタイプの資金調達と開発を行った。その後、コンソーシアムは電子顕微鏡メーカーFEIと協力し、新しい設計の展開と販売を開始した。ほぼ同じ時期に、カリフォルニア州プレザントンのガタン社は、ピーター・ディーン（ローレンス・バークレー国立研究所）とデビッド・アガード（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）が設計した同様の検出器を発表した。3番目のタイプのカメラは、ダイレクト・エレクトロン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のグエン・フー・シュオンによって開発された。^[11]

最近では、タンパク質ベースのイメージングスキャフォールドの使用の進歩により、サンプルの向きの偏りやサイズ制限の問題が解決されつつあります。約 50 kDa未満のタンパク質は、一般的に信号対雑音比(SNR)が低すぎて、画像内のタンパク質粒子を分解できず、3D 再構成が困難または不可能になります。^[13]より小さなタンパク質の SNR は、イメージングスキャフォールドに結合することで改善できます。UCLA の Yeates グループは、剛性のイメージングスキャフォールドを使用し、スキャフォールドと対象タンパク質間のモジュラー結合ドメインとしてDARPin を使用することで、KRASの 3 つの変異体 (サイズは約 19 kDa) のより鮮明な画像を作成することができました。^[14]

クライオ電子顕微鏡が生化学に与えた影響が認められ、ジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンの3人の科学者が「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡の開発」によりノーベル化学賞を受賞した。 ^[4]

従来、X線結晶構造解析は、生体分子の3D構造を決定するための最も一般的な技術でした。^[15]しかし、前述のクライオ電子顕微鏡の改良により、生体分子の詳細を調べるツールとしての人気が高まっています。2010年以降、クライオ電子顕微鏡による年間構造の蓄積は、X線結晶構造解析を上回っています。^[16] X線結晶構造解析は、数十年にわたる長い歴史のため、蓄積の総量が大幅に多いですが、2つの方法の総蓄積量は2035年頃に上回ると予測されています。^[16]

X線結晶構造解析の解像度は結晶の均質性によって制限され、^[17]理想的な結晶化条件が不明な生物学的分子を結晶状態に誘導するには非常に時間がかかり、極端な場合には数か月から数年かかることもあります。^[18]対照的に、クライオ電子顕微鏡でのサンプル調製では、タンパク質凝集や優先配向などの問題を克服するために、複数回のスクリーニングと最適化が必要になる場合があります。 ^{[19] [20]}しかし、サンプルが結晶を形成する必要はなく、クライオ電子顕微鏡のサンプルは急速冷凍され、ほぼ天然の状態で検査されます。^[21]

Proteopediaによると、タンパク質データバンクにおけるX線結晶構造解析による平均解像度（2019年5月19日現在）は2.05Åであり、^[17]記録上最高の解像度（2022年9月30日現在）は0.48Åである。^[22] 2020年現在、クライオ電子顕微鏡で決定されたタンパク質構造の大部分は、3～4Åの低い解像度である。^[23] ただし、2020年現在、最高のクライオ電子顕微鏡解像度は1.22Åで記録されており、^[20]場合によっては解像度の面で競合する可能性がある。

2019年には相関光クライオTEMとクライオETを用いて神経細胞内のトンネルナノチューブ（TNT）を観察した。^[24]

走査型電子顕微鏡法(cryoSEM) は、極低温チャンバー内に走査型電子顕微鏡のコールドステージを備えた 走査型電子顕微鏡法技術です。

極低温透過型電子顕微鏡(cryo-TEM) は、構造生物学および材料科学で使用される透過型電子顕微鏡技術です。口語的には、「極低温電子顕微鏡」またはその短縮形である「cryo-EM」という用語は、デフォルトで極低温透過型電子顕微鏡を指します。これは、cryo-EM の大部分が走査型電子顕微鏡ではなく透過型電子顕微鏡で行われるためです。

連邦工科大学、ローザンヌ大学、ジュネーブ大学は、クライオ電子顕微鏡法の応用とさらなる開発を目的として、2021年11月末にデュボシェイメージングセンター（DCI）を開設した。^[25] SARS-CoV-2オミクロン変異体が初めて特定されてから1か月も経たないうちに、DCIの研究者らはその構造を定義し、個々のワクチンを回避するための重要な変異を特定し、新しい治療法への洞察を提供することができた。^[26]

EMBION としても知られるデンマーク国立クライオ電子顕微鏡施設は、2016 年 12 月 1 日に開設されました。EMBION は、デンマークの大学 (オーフス大学がホスト、コペンハーゲン大学が共同ホスト) 間のクライオ電子顕微鏡コンソーシアムです。

• 極低温電子トモグラフィー（クライオET）は、個々のサンプルを様々な傾斜角度で多数撮影し、単一のサンプルの3D再構成を行う特殊なアプリケーションです。^[27]
• 電子結晶学、 TEM を使用して固体中の原子の配列を決定する方法
• マイクロED [ ^28] 3D結晶からの電子回折を用いてタンパク質、ペプチド、有機分子、無機化合物の構造を決定する方法^{[29] [30] [31]}
• 単粒子解析クライオ電子顕微鏡法は、単分散サンプルからタンパク質構造を決定するための平均化法である。^[32]

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  非晶質氷中に浮遊するGroELのクライオ電子顕微鏡画像50000倍の倍率
• クライオ電子顕微鏡によるピキア・パストリスのアルコール酸化酵素の構造
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  アイアン マウンテン バイオフィルムからの完全な ARMAN 細胞の Cryo-EM 画像。画像の幅は 576 nm です。
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  CroV巨大海洋ウイルスのクライオ電子顕微鏡画像
  （スケールバーは200nmを表す）^[33]

• 凍結固定
• クライオ生体結晶学
• 電子トモグラフィー（ET）