蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡は、有機物または無機物の特性を研究するために、散乱、反射、減衰または吸収の代わりに、またはそれらに加えて蛍光を使用する光学顕微鏡です。^{[ 1 ] [ 2 ]}蛍光顕微鏡は、蛍光を使用して画像を生成する顕微鏡であり、落射蛍光顕微鏡のような単純な構成でも、蛍光画像の解像度を向上させるために光学的断層撮影を使用する共焦点顕微鏡 のようなより複雑な設計でも、同様です。 ^{[ 3 ]}

試料は特定の波長（または複数の波長）の光で照射され、蛍光色素によって吸収され、吸収された光よりも長い波長（つまり、吸収された光とは異なる色）の光を放出します。照射光は、スペクトル放出フィルターを使用して、はるかに弱い放出蛍光から分離されます。蛍光顕微鏡の典型的な構成要素は、光源（キセノンアークランプまたは水銀蒸気ランプが一般的です。より高度な形態では、高出力LEDおよびレーザー）、励起フィルター、ダイクロイックミラー（またはダイクロイックビームスプリッター）、および放出フィルターです（下図参照）。フィルターとダイクロイックビームスプリッターは、試料の標識に使用される蛍光色素のスペクトル励起および放出特性に合うように選択されます。^{[ 1 ]}このようにして、一度に単一の蛍光色素（色）の分布が画像化されます。複数の種類の蛍光色素の多色画像は、複数の単色画像を組み合わせることによって構成する必要があります。^{[ 1 ]}

現在使用されている蛍光顕微鏡のほとんどは落射蛍光顕微鏡であり、蛍光色素の励起と蛍光の検出は同じ光路（すなわち対物レンズ）を通して行われます。これらの顕微鏡は生物学分野で広く用いられており、共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡（TIRF）といった、より高度な顕微鏡設計の基礎となっています。

落射蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡の大部分、特に生命科学分野で使用されるものは、図に示すような落射蛍光方式を採用しています。励起波長の光が対物レンズを通して試料を照射します。試料から放出された蛍光は、励起に使用したのと同じ対物レンズによって検出器に集光されます。より高い解像度を得るには、開口数の高い対物レンズが必要になります。励起光の大部分は試料を透過するため、反射された励起光のみが放出光とともに対物レンズに到達します。そのため、落射蛍光法は高い信号対雑音比を実現します。ダイクロイックビームスプリッターは波長選択フィルターとして機能し、蛍光を接眼レンズまたは検出器に透過させますが、残りの励起光は光源に向かって反射します。

蛍光顕微鏡では、ハロゲンランプなどの一般的な光源では提供できない、強力でほぼ単色の照明が必要です。^{[ 4 ]}光源としては、キセノンアークランプや励起フィルター付き水銀蒸気ランプ、レーザー、スーパーコンティニューム光源、高出力LEDの4種類が主に使われています。レーザーは、共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡などのより複雑な蛍光顕微鏡技術に最も広く使われており、キセノンランプ、水銀ランプ、ダイクロイック励起フィルター付きLEDは、広視野落射蛍光顕微鏡によく使われています。広視野落射蛍光顕微鏡の照明経路に2つのマイクロレンズアレイを配置することで、 ^{[ 5 ]}変動係数1～2%の非常に均一な照明を実現できます。

蛍光顕微鏡検査に適したサンプルであるためには、サンプルが蛍光を発している必要があります。蛍光サンプルを作成する方法はいくつかあり、主な技術は蛍光染色剤による標識、または生物学的サンプルの場合は蛍光タンパク質の発現です。あるいは、サンプルの固有の蛍光（つまり、自家蛍光）を使用することもできます。^{[ 1 ]}生命科学において、蛍光顕微鏡検査は、タンパク質やその他の目的の分子の分布を検出するために、標本を特異的かつ高感度に染色できる強力なツールです。その結果、生物学的サンプルの蛍光染色にはさまざまな技術があります。

蛍光色素は、光照射を受けると蛍光を発する能力を失います。この現象は光退色と呼ばれます。光退色は、蛍光分子が蛍光時に励起された電子によって化学的損傷を受けることで発生します。光退色は、蛍光顕微鏡による試料観察時間を著しく制限する可能性があります。光退色を軽減するための技術はいくつかあり、例えば、より強靭な蛍光色素の使用、照射量の最小化、または光保護スカベンジャー剤の使用などが挙げられます。

蛍光レポータータンパク質を用いた蛍光顕微鏡法により、生細胞の蛍光顕微鏡観察が可能になったが、細胞は光毒性、特に短波長光に対する光毒性を受けやすい。さらに、蛍光分子は光照射下で反応性化学種を生成する傾向があり、これが光毒性効果を増強する。

透過光顕微鏡や反射光顕微鏡とは異なり、蛍光顕微鏡では蛍光標識された特定の構造のみを観察できます。例えば、蛍光DNA染色を施した組織サンプルを蛍光顕微鏡で観察すると、細胞内のDNAの構造のみが明らかになり、細胞形態に関するその他の情報は得られません。

蛍光信号は非蛍光画像（明視野など）から推定するという計算手法によって、これらの懸念が軽減される可能性がある。^{[ 9 ]}一般的に、これらの手法では、染色された細胞で深層畳み込みニューラルネットワークをトレーニングし、染色されていないサンプルで蛍光を推定する。このように、調査対象の細胞とネットワークのトレーニングに使用した細胞を切り離すことで、イメージングをより迅速に、光毒性を低減して実行できる。

光の波動性により、回折限界によって光を集光できるスポットのサイズが制限されます。この限界は19世紀にエルンスト・アッベによって記述され、「光学顕微鏡の解像度は、使用する光の波長の約半分に制限される」とされています。蛍光顕微鏡は、特殊な光学構成によってこの限界を超えることを目指す多くの技術の中心となっています。

20世紀には顕微鏡技術の改良がいくつか発明され、ある程度解像度とコントラストが向上しました。しかし、回折限界を克服することはできませんでした。1978年に、4Pi顕微鏡を共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡として使用することでこの障壁を打破する最初の理論的アイデアが開発されました。これは、光を理想的にはあらゆる方向から共通の焦点に集束させ、「点ごとの」励起と「点ごとの」検出を組み合わせて対象物を走査するために使用されます。^{[ 10 ]} しかし、4pi顕微鏡の最初の実験的実証は1994年に行われました。 ^{[ 11 ]} 4Pi顕微鏡は、2つの対向する対物レンズを使用するか、赤方偏移光と多光子励起を使用する2光子励起顕微鏡を使用することで、利用可能な焦点方向の数を最大化します。

統合相関顕微鏡法は、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡を組み合わせたものです。これにより、蛍光顕微鏡のデータを標識ツールとして使用しながら、電子顕微鏡で超微細構造とコンテキスト情報を可視化することができます。 ^{[ 12 ]}

回折限界以下の解像度を初めて実現した技術は、1994年に提唱されたSTED顕微鏡法です。この方法とRESOLFTコンセプトに基づくすべての技術は、光と蛍光分子間の強い非線形相互作用を利用しています。分子はそれぞれの特定の場所で識別可能な分子状態の間を強く遷移するため、最終的に光は空間のごく一部からのみ放出され、結果として解像度が向上します。

1990年代には、広視野顕微鏡法に基づく別の超解像顕微鏡法も開発されました。蛍光マーカーで染色された細胞ナノ構造のサイズ分解能が大幅に向上したのは、SPDM局在顕微鏡法と構造化レーザー照明（空間変調照明、SMI）の開発によるものです。^{[ 13 ]} SPDMの原理とSMIを組み合わせることで、Vertico SMI顕微鏡が開発されました。^{[ 14 ] [ 15 ]}緑色蛍光タンパク質（GFP）などの通常の点滅蛍光色素の単一分子検出は、SPDMをさらに発展させたSPDMphymod技術を使用することで実現できます。この技術は、分子レベルで2種類の異なる蛍光分子を検出およびカウントすることを可能にします（この技術は、2色局在顕微鏡法または2CLMと呼ばれます）。^{[ 16 ]}

あるいは、光活性化局在顕微鏡法の登場により、単一分子の点滅やスイッチングを利用することで同様の結果が得られる可能性がある。この場合、蛍光を発する分子の割合は各時点で非常に小さい。照射光に対する分子のこのような確率的な応答は、非常に非線形な相互作用に対応し、回折限界以下の解像度をもたらす。

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  骨肉腫細胞のZ軸投影画像。アクチンフィラメントを可視化するためにファロイジンで染色した。画像は共焦点顕微鏡で撮影し、その後のデコンボリューションは実験的に導出された点像分布関数を用いて行った。
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  分裂中のヒトがん細胞における3つの構成要素のエピ蛍光イメージング。DNAは青色、INCENPと呼ばれるタンパク質は緑色、微小管は赤色に染色されている。各蛍光色素は、励起フィルターと発光フィルターの異なる組み合わせを用いて個別にイメージングされ、デジタルCCDカメラで順次撮影された後、重ね合わせて完全な画像が得られる。
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  顕微鏡下の内皮細胞。核はDAPIで青色に染色され、微小管はFITC結合抗体で緑色に標識され、アクチンフィラメントはTRITC結合ファロイジンで赤色に標識されている。ウシ肺動脈内皮細胞（BPAE細胞）。
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  乳腺細胞中のHer2およびHer3を用いた3Dデュアルカラー超解像顕微鏡観察、標準色素：Alexa 488、Alexa 568。LIMON顕微鏡
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  DAPIで染色したヒトリンパ球核に、13番染色体（緑色）と21番染色体（赤色）のセントロメアプローブをハイブリダイゼーションさせた（蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH））。
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  酵母細胞膜は、RFPおよびGFP蛍光マーカーと融合させた膜タンパク質によって可視化される。両方のマーカーからの光を照射すると黄色に発色する。
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  超解像顕微鏡：ヒトがん細胞における単一YFP分子の検出。Vertico -SMI/SPDMphymod顕微鏡で測定した 典型的な距離測定値は15nmの範囲である。
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  超解像顕微鏡：GFPとRFP融合タンパク質を用いた共局在顕微鏡（2CLM）（骨癌細胞の核） Vertico-SMI/SPDMphymod顕微鏡で測定した広視野領域（470 μm²）内 の^{120,000個の局在分子}
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  ヒト野生型およびP239S変異型パラジンにおけるDNA発現の蛍光顕微鏡観察
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  血液細胞における太陽フレア病変の蛍光顕微鏡画像。影響を受けた領域が赤色で示されている。

• Fluorophores.org、蛍光色素のデータベース
• 顕微鏡リソースセンター（ 2014年10月22日、 Wayback Machineにアーカイブ済み）
• 蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡など、様々な種類の顕微鏡に関するアニメーションと解説（パリ南大学）