リボザイム

リボザイム（リボ核酸酵素）は、タンパク質酵素の作用に似た、遺伝子発現におけるRNAスプライシングを含む特定の生化学反応を触媒する能力を持つRNA分子です。1982年のリボザイムの発見は、RNAが遺伝物質（DNAなど）と生物学的触媒（タンパク質酵素など）の両方になり得ることを実証し、RNAが前生物的自己複製システムの進化に重要であった可能性があることを示唆するRNAワールド仮説に貢献しました。^[1]

天然または試験管内で進化したリボザイムの最も一般的な活動は、RNAとDNAの切断（またはライゲーション）とペプチド結合の形成です。^[2]たとえば、知られている最小のリボザイム（GUGGC-3'）は、PheAMPの存在下でGCCU-3'配列をアミノアシル化できます。^[3]リボソーム内では、リボザイムはタンパク質合成中にアミノ酸を結合する大サブユニットリボソームRNAの一部として機能します。また、 RNAスプライシング、ウイルス複製、転移RNA生合成など、さまざまなRNA処理反応に関与しています。リボザイムの例には、ハンマーヘッドリボザイム、VSリボザイム、リードザイム、ヘアピンリボザイムなどがあります。

RNAワールド仮説を通じて生命の起源を研究している研究者は、自己複製能力を持つリボザイムの発見に取り組んでいますが、そのためにはRNAポリマーを触媒的に合成する能力が必要です。これは、情報の劣化を防ぐために高いコピー精度を維持しながら、ダーウィンの進化を進行させるためにコピープロセス中に時折エラーが発生することを許容する、生命誕生前に適した条件で起こるはずです。^[4]

リボザイムを治療薬として、特定のRNA配列を切断する酵素として、バイオセンサーとして、また機能ゲノミクスや遺伝子発見への応用として開発する試みがなされてきた。 ^[5]

リボザイムが発見される前は、酵素（触媒タンパク質としてのみ定義されていた）が唯一の既知の生物学的触媒でした。1967年、カール・ウーゼ、フランシス・クリック、レスリー・オーゲルは、RNAが触媒として作用する可能性があることを初めて示唆しました。この考えは、RNAが複雑な二次構造を形成できるという発見に基づいていました。^[6]これらのリボザイムは、転写産物から除去されたRNA転写産物のイントロンと、プレtRNAの成熟に関与するRNase P複合体のRNA成分で発見されました。1989年、トーマス・R・チェックとシドニー・アルトマンは、「RNAの触媒特性の発見」によりノーベル化学賞を共同受賞しました。 ^[7]リボザイムという用語は、1982年にCellに掲載された論文でケリー・クルーガーらによって初めて導入されました。^[1]

生物学では、触媒作用はタンパク質にのみ存在するという確固たる信念がありました。しかし、RNA 触媒作用の考えは、生命の起源に関する古い疑問に一部基づいています。細胞の働きをする酵素と、酵素を生成するために必要な情報を運ぶ核酸のどちらが先に生まれたのでしょうか? 「触媒としてのリボ核酸」という概念は、この問題を回避します。本質的に、RNA は鶏と卵の両方になり得ます。^[8]

1980年代、コロラド大学ボルダー校のトーマス・チェックは、テトラヒメナ・サーモフィラのリボソームRNA遺伝子のイントロンの切除について研究していました。スプライシング反応の原因となる酵素を精製しようとしたとき、チェックは細胞抽出物を加えなくてもイントロンを切り出せることを発見しました。チェックと彼の同僚たちはどんなに努力したにもかかわらず、スプライシング反応に関連するタンパク質を特定できませんでした。多くの研究の末、チェックはRNAのイントロン配列部分がリン酸ジエステル結合を切断して再結合できるのではないかと提唱しました。ほぼ同じ頃、イェール大学の教授であるシドニー・アルトマンは、tRNA分子が細胞内で処理される方法を研究していたときに、彼の同僚とともに前駆体tRNAを活性tRNAに変換する役割を持つRNase-Pと呼ばれる酵素を単離しました。驚いたことに、彼らはRNase-Pにはタンパク質に加えてRNAが含まれており、RNAが活性酵素の必須成分であることを発見しました。これはあまりにも未知のアイデアだったため、彼らは研究結果を発表するのに苦労しました。翌年^{[何年? ]}、アルトマンは、RNase-P RNA サブユニットがタンパク質成分が存在しない状態でも前駆体 tRNA を活性 tRNA に切断する触媒作用を示すことで、RNA が触媒として作用できることを実証しました。

チェックとアルトマンの発見以来、他の研究者らが自己切断RNAまたは触媒RNA分子の他の例を発見している。多くのリボザイムはヘアピンまたはハンマーヘッド型の活性中心と、特定の配列で他のRNA分子を切断できる独自の二次構造を持っている。現在では、あらゆるRNA分子を特異的に切断するリボザイムを作ることが可能になっている。これらのRNA触媒は、医薬品として利用できる可能性がある。例えば、リボザイムはHIVのRNAを切断するように設計されている。このようなリボザイムが細胞によって作られれば、侵入するすべてのウイルス粒子のRNAゲノムはリボザイムによって切断され、感染を防ぐことができる。

タンパク質に見られる20 個のアミノ酸側鎖と比較すると、各モノマー単位 (ヌクレオチド) に 4 つの選択肢しかないにもかかわらず、リボザイムは多様な構造とメカニズムを持っています。多くの場合、リボザイムはタンパク質の対応するメカニズムを模倣することができます。たとえば、自己切断リボザイム RNA では、2' ヒドロキシル基を求核剤として使用して架橋リン酸を攻撃し、N+1 塩基の 5' 酸素を脱離基として作用させるインライン SN2 反応が実行されます。比較すると、同じ反応を触媒するタンパク質である RNase A は、配位ヒスチジンとリジンを塩基として使用してリン酸骨格を攻撃します。^{[2] [説明が必要]}

多くのタンパク質酵素と同様に、金属結合も多くのリボザイムの機能にとって重要です。^[9]多くの場合、これらの相互作用はリン酸骨格とヌクレオチドの塩基の両方を使用し、劇的な構造変化を引き起こします。^[10]金属の存在下でのリン酸ジエステル骨格の切断には2つのメカニズムクラスがあります。最初のメカニズムでは、内部の2'-OH基がSN 2メカニズムでリン中心を攻撃します_。金属イオンは、最初にリン酸酸素を配位し、次にオキシアニオンを安定化することで、この反応を促進します。2番目のメカニズムもSN _{2置換に従いますが、求核剤はRNA自体ではなく、水または外因性ヒドロキシル基に由来します。最小のリボザイムはUUUで、Mn} ²⁺の存在下で最初のメカニズムを介してGAAAテトラヌクレオチドのGとAの間の切断を促進できます。このトリヌクレオチド（相補的なテトラマーではなく）がこの反応を触媒する理由は、UUU-AAAペアリングが64の立体配座の中で最も弱く、最も柔軟なトリヌクレオチドであり、Mn2 ⁺の結合部位を提供するためであると考えられる。^[11]

リン酸基転移は金属イオンなしでも触媒される。例えば、膵臓リボヌクレアーゼAや肝炎デルタウイルス（HDV）リボザイムは、金属イオンなしで酸塩基触媒を介してRNAバックボーンの切断を触媒することができる。^{[12] [13]}ヘアピンリボザイムも金属イオンなしでRNAの自己切断を触媒することができるが、そのメカニズムはまだ不明である。^[13]

リボザイムは活性化エントロピーを下げることで隣接するアミノ酸間のペプチド結合の形成を触媒することもできる。^[12]

リボザイムはほとんどの細胞では非常にまれですが、その役割は生命にとって不可欠な場合があります。たとえば、RNAをタンパク質に翻訳する生物学的機械であるリボソームの機能部分は、基本的にリボザイムであり、RNAの三次構造モチーフで構成されており、多くの場合、 Mg ²⁺などの金属イオンが補因子として配位しています。^{[14]モデルシステムでは、触媒と相補的な3塩基対を持つ4ヌクレオチド基質の}トランスフェニルアラニン化を触媒する5ヌクレオチドRNAに二価カチオンは必要ありません。ここで、触媒/基質はC3リボザイムの切断によって考案されました。^[15]

最もよく研​​究されているリボザイムは、おそらくチェフ^[16]とアルトマン^[17]による最初の発見のように、自分自身または他のRNAを切断するものである。しかし、リボザイムはさまざまな反応を触媒するように設計することができ、その多くは生命体で起こる可能性があるが、細胞内では発見されていない。^[18]

RNAはシャペロニンと同様の方法でプリオンの病理学的タンパク質構造の折り畳みを触媒する可能性がある。^[19]

RNA は遺伝分子としても機能するため、ウォルター・ギルバートは、遠い昔、細胞はRNA を遺伝物質と構造および触媒分子の両方として使用していたと提唱しました。これは、今日のようにDNAとタンパク質の間でこれらの機能を分担しているわけではありません。この仮説は、生命の起源に関する「 RNA ワールド仮説」として知られています。^[20]ヌクレオチドとRNA (したがってリボザイム) は無機化学物質によって生成できるため、最初の酵素の候補であり、実際には最初の「レプリケーター」(つまり、自己複製する情報を含む高分子) です。2 つの基質を連結して自分自身の正確なコピーを生成する自己複製リボザイムの例は、2002 年に説明されました。^[21] RNA の触媒活性の発見により、生命の起源に関する「鶏が先か卵が先か」のパラドックスが解決され、ペプチドと核酸の起源のセントラルドグマの問題が解決されました。このシナリオによれば、生命の起源において、すべての酵素活動と遺伝情報のエンコードは 1 つの分子、RNA によって行われました。

実験室では、非常に特殊な条件下で活性化モノマーから他のRNA分子の合成を触媒できるリボザイムが生産されており、これらの分子はRNAポリメラーゼリボザイムとして知られています。^[22]最初のRNAポリメラーゼリボザイムは1996年に報告され、最大6ヌクレオチド長のRNAポリマーを合成することができました。^{[23]ランダムRNA配列の大規模なプールからRNAリガーゼリボザイムの} 突然変異誘発と選択が行われ、^[24] 2001年に改良された「ラウンド18」ポリメラーゼリボザイムが分離され、現在では最大14ヌクレオチド長のRNAポリマーを触媒できるようになりました。^{[25]ラウンド18リボザイムにさらなる選択を適用すると、B6.61リボザイムが生成され、リン酸ジエステル結合の切断によって分解されるまで、24時間以内にプライマーテンプレートに最大20}ヌクレオチドを追加できるようになりました。^[26]

リボザイムがRNA配列を重合する速度は、ミセル内で起こると大幅に増大する。^[27]

次に発見されたリボザイムは「tC19Z」リボザイムで、0.0083変異/ヌクレオチドの忠実度で最大95ヌクレオチドを追加できます。 ^[28]次に、「tC9Y」リボザイムが研究者によって発見され、さらに、氷点下の共晶相条件で最大206ヌクレオチドの長さのRNA鎖を合成できるようになりました。^[29]この条件は、以前にリボザイムポリメラーゼ活性を促進することが示されていました。^[30]

tC9-4Mと呼ばれるRNAポリメラーゼリボザイム（RPR）は、マグネシウムイオン濃度が生理学的レベルに近い状態で、それ自体よりも長い（つまり177nt以上）RNA鎖を重合することができたが、それ以前のRPRでは、プレバイオティクス的にはあり得ない200mMまでの濃度が必要だった。これを達成するために必要な唯一の要素は、リジンデカペプチドと呼ばれる非常に単純なアミノ酸ポリマーの存在であった。^[31]

その時点で合成された最も複雑なRPRは24-3と呼ばれ、多種多様なヌクレオチド配列を重合し、以前のリボザイムではアクセスできなかったRNA基質の複雑な二次構造をナビゲートする新しい能力を持っていました。実際、この実験はリボザイムを使用してtRNA分子を合成した最初の実験でした。^[32] 24-3リボザイムから始めて、Tjhungら^{[33]はさらに14ラウンドの選択を適用し、} in vitro進化によって「38-6」と呼ばれるRNAポリメラーゼリボザイムを取得しました。これは複雑なRNA分子をコピーする前例のないレベルの活性を持っています。しかし、このリボザイムは自分自身をコピーすることができず、そのRNA産物は高い突然変異率を持っています。その後の研究では、研究者らは38-6リボザイムから始めて、さらに14ラウンドの選択を適用して「52-2」リボザイムを生成しました。これは38-6と比較して、再び何倍も活性が高く、検出可能で機能的なレベルのクラスIリガーゼを生成し始めることができましたが、T7 RNAポリメラーゼなどのタンパク質による同じテンプレートのコピーと比較すると、忠実度と機能性にはまだ限界がありました。^[34]

t5(+1)と呼ばれるRPRは、一度に1ヌクレオチドではなく、3ヌクレオチドずつ追加します。このヘテロ二量体RPRは、ヘアピンなど、24-3ではアクセスできない二次構造をナビゲートできます。Z RPRとして知られる以前に合成されたRPRのみから派生したRNAバリアントの初期プールでは、2つの配列が別々に出現し、相互に依存するように進化しました。タイプ1 RNAは触媒的に不活性になるように進化しましたが、タイプ5 RNAとの複合体形成により重合能力が向上し、RNAテンプレート基質との分子間相互作用が可能になり、以前の研究の制限であったRPRのRNA配列にテンプレートを直接つなぐ必要がなくなりました。t5(+1)はテンプレートへのつなぐ必要がなかっただけでなく、プライマーも必要ありませんでした。t5(+1)は3' → 5'と5' 3 → 3'の両方向でテンプレートを重合する能力があったからです。^[35]

高度に進化した^{[曖昧な] RNAポリメラーゼリボザイムは}逆転写酵素として機能することができました。つまり、RNAテンプレートを使用してDNAコピーを合成することができます。^[36]このような活動は^{[誰によって？ ]}地球上の生命の初期の歴史においてRNAゲノムからDNAゲノムへの移行に不可欠であったと考えられています。逆転写能力は、初期のRNA依存性RNAポリメラーゼリボザイムの二次的な機能として発生した可能性があります。

リボザイムに折り畳まれるRNA配列は、二重鎖RNAに侵入し、開いたホロポリメラーゼ複合体に再配置し、特定のRNAプロモーター配列を検索し、認識されると、配列の相補鎖を重合するプロセッシブフォームに再び再配置することができます。このリボザイムは、二重鎖RNAを最大107ヌクレオチドまで延長することができ、重合される配列を固定する必要はありません。^[37]

生体内に存在するリボザイムの発見以来、研究室で作られる新しい合成リボザイムの研究に関心が寄せられてきました。例えば、優れた酵素活性を持つ人工的に生成された自己切断RNAが生産されています。TangとBreaker ^{[38]は、ランダム配列RNAに由来するRNAの}試験管内選択によって自己切断RNAを単離しました。生産された合成リボザイムの中には新しい構造を持つものもあれば、天然のハンマーヘッドリボザイムに類似したものもありました。

2015年、ノースウェスタン大学とイリノイ大学シカゴ校の研究者らは、細胞内のすべてのタンパク質と酵素を生成する本物の細胞成分とほぼ同じように機能する連結リボソームを設計した。リボソームTまたはリボTと呼ばれるこの人工リボソームは、マイケル・ジュエットとアレクサンダー・マンキンによって作成された。^[39]人工リボザイムを作成するために使用される技術には、指向性進化が含まれる。このアプローチは、RNAが触媒としても情報ポリマーとしても二重の性質を持つことを利用し、研究者がポリメラーゼ酵素を使用してRNA触媒の膨大な集団を容易に生成できるようにする。リボザイムは、逆転写酵素でさまざまなcDNAに逆転写することによって変異させ、エラーを起こしやすいPCRで増幅する。これらの実験における選択パラメータは多くの場合異なる。リガーゼリボザイムを選択するための1つのアプローチは、基質に共有結合したビオチンタグを使用することである。分子が望ましいリガーゼ活性を持っている場合、ストレプトアビジンマトリックスを使用して活性分子を回収できます。

リンカーンとジョイスは、試験管内進化を利用して、事前に合成された高度に相補的なオリゴヌクレオチドを結合することにより、約1時間で自己複製できるリボザイムリガーゼを開発しました。^[40]

真の触媒ではないが、人工の自己切断型リボスイッチ（アプタザイムと呼ばれる）の作成も研究が盛んに行われている分野である。リボスイッチは、翻訳を制御するために小分子リガンドに反応して構造を変化させる調節性RNAモチーフである。幅広い代謝物やその他の小さな有機分子に結合する天然のリボスイッチは数多く知られているが、リボスイッチに基づくリボザイムはglmSのみが記載されている。^[41]自己切断型リボスイッチの特徴付けの初期の研究は、リガンドとしてテオフィリンを使用することに焦点を当てていた。これらの研究では、リボソーム結合部位をブロックするRNAヘアピンが形成され、翻訳が阻害される。リガンド（この場合はテオフィリン）の存在下では、調節性RNA領域が切断され、リボソームが標的遺伝子に結合して翻訳できるようになる。このRNAエンジニアリング研究の多くは、上記の例のような指向性進化ではなく、合理的な設計と以前に決定されたRNA構造に基づいていた。最近の研究では、リボザイムリボスイッチに使用されるリガンドの範囲が広がり、チミンピロリン酸が含まれるようになった。蛍光活性化細胞選別法もアプタザイムのエンジニアリングに使用されている。^[42]

リボザイムは、遺伝子治療による疾患の治療のために提案され、開発されてきました。RNA ベースの酵素を治療薬として使用する場合の大きな課題の 1 つは、体内での触媒 RNA 分子の半減期が短いことです。この問題に対処するために、リボースの 2' 位置を変更して RNA の安定性を向上させます。リボザイム遺伝子治療の 1 つの分野は、RNA ベースのウイルスの阻害です。

HIV RNAを標的とした合成リボザイムの一種である遺伝子シアーが開発され、HIV感染に対する臨床試験が開始された。^{[43] [44]}

同様に、リボザイムはC型肝炎ウイルスRNA、SARSコロナウイルス（SARS-CoV）^{[45] 、} アデノウイルス^[45]、インフルエンザA型およびB型ウイルスRNAを標的とするように設計されている。^{[46] [47] [48] [45]}リボザイムはウイルスゲノムの保存領域を切断することができ、哺乳類細胞培養においてウイルスを減少させることが示されている。^[49]研究者によるこれらの努力にもかかわらず、これらのプロジェクトは前臨床段階にとどまっている。

十分に検証された天然に存在するリボザイムのクラス:

• トム・チェックのショートトーク：「リボザイムの発見」