X線結晶構造解析

X線結晶学は、化学結合と非共有結合相互作用の理解を深めることにつながった。初期の研究では、原子の典型的な半径が明らかになり、ダイヤモンド構造における炭素の四面体結合^{[ 30 ]} 、ヘキサクロロ白金酸アンモニウム(IV)で観察された金属の八面体結合^{[ 48 ] 、平面炭酸基[ 33 ]}および芳香族分子[49]で観察された共鳴など、化学結合の多くの理論的モデルが確認された。^{キャスリーン・} ロンズデールによる1928年のヘキサメチルベンゼンの構造^{[ 50 ]}は、ベンゼンの六方対称性を確立し、脂肪族C-C結合と芳香族C-C結合の結合長の明確な違いを示した。この発見は、化学結合間の共鳴というアイデアにつながり、化学の発展に大きな影響を与えた。^{[ 51 ]}彼女の結論は、ウィリアム・ヘンリー・ブラッグによって先取りされており、彼は1921年に他の分子に基づいてナフタレンとアントラセンのモデルを発表した。これは分子置換の初期形態である。^{[ 49 ] [ 52 ]}

有機化合物であるヘキサメチレンテトラミンの最初の構造は、1923 年に解明されました。^{[ 53 ]}これに続いて、生体膜の重要な構成要素であるさまざまな長鎖脂肪酸に関するいくつかの研究が急速に行われました。^{[ 54 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ] [ 61 ] [ 62 ]} 1930 年代には、2 次元的に複雑なはるかに大きな分子の構造が解明され始めました。重要な進歩は、ヘム、コリン、クロロフィルなどの生物学で重要なポルフィリン分子と密接に関連する大きな平面分子であるフタロシアニンの構造でした。^{[ 63 ]}

1920年代、ヴィクトル・モーリッツ・ゴルトシュミット、そして後にライナス・ポーリングは、化学的にあり得ない構造を排除し、原子の相対的な大きさを決定するための規則を開発した。これらの規則は、ブルッカイトの構造（1928年）の解明と、二酸化チタンのルチル、ブルッカイト、アナターゼの各形態の相対的な安定性の理解につながった。

2 つの結合原子間の距離は、結合強度とその結合次数に対する敏感な尺度です。そのため、X 線結晶学の研究により、金属-金属二重結合^{[ 64 ] [ 65 ] [ 66 ]} 、金属-金属四重結合 [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ]、^{および3中心2電子結合 [ 70 ]}など、^{無機化学における}さらにエキゾチックなタイプの結合が発見されました。X線結晶学、厳密には非弾性コンプトン散乱実験は、水素結合の部分的共有結合性も証明しました。^{[ 71 ]}有機金属化学の分野では、フェロセンの X 線構造が^{サンドイッチ}化合物の科学的研究を開始し^{[ 72 ] [ 73 ]}、ツァイゼ塩の構造は^{「バックボンディング」と金属-π 錯体の研究を}刺激しました。^{[ 74 ] [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ]}最後に、X線結晶学は超分子化学の発展において先駆的な役割を果たし、特にクラウンエーテルの構造とホスト-ゲスト化学の原理を解明しました。

フラーレン、メタロポルフィリン、その他の複雑な化合物など、多くの複雑な無機系および有機金属系が単結晶法を用いて分析されてきた。単結晶回折は医薬品業界でも使用されている。ケンブリッジ構造データベースには、2019年6月時点で100万を超える構造が収録されており、これらの構造のほとんどはX線結晶構造解析によって決定されたものである。^{[ 78 ]}

鉱物学への X 線結晶学の応用は、 1924 年にメンツァーによって決定されたガーネットの構造から始まった。 1920 年代には、ケイ酸塩の体系的な X 線結晶学的研究が行われた。 この研究により、Si / O比が変化すると、ケイ酸塩結晶の原子配列に大きな変化が生じることが示された。 マハツキは、ケイ酸塩のケイ素原子をアルミニウムが置換する鉱物にこれらの知見を拡張した。冶金学への X 線結晶学の最初の応用も 1920 年代半ばに行われた。^{[ 80 ] [ 81 ] [ 82 ] [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]}特に注目すべきは、ライナス・ポーリングによる Mg ₂ Sn合金の構造^{[ 86 ]}が、複雑なイオン結晶の安定性と構造に関する彼の理論につながったことである。^{[ 87 ]}

2012年10月17日、火星の「ロックネスト」にあるキュリオシティ探査車は、火星の土壌のX線回折分析を初めて実施した。探査車のCheMin分析装置による分析結果から、長石、輝石、カンラン石などのいくつかの鉱物の存在が明らかになり、サンプル中の火星の土壌はハワイの火山の「風化した玄武岩質土壌」に似ていることが示唆された。^{[ 79 ]}

生体分子のX線結晶学は、ドロシー・クロウフット・ホジキンによって飛躍的に発展した。彼女はコレステロール（1937年）、ペニシリン（1946年）、ビタミンB12 _（ 1956年）の構造を解明し、1964年にノーベル化学賞を受賞した。 1969年には、30年以上研究を続けたインスリンの構造解明に成功した。^{[ 88 ]}

タンパク質（不規則な形状でコレステロールの数百倍の大きさ）の結晶構造は、1950年代後半に解明され始めました。その始まりは、ジョン・カウダリー・ケンドリュー卿によるマッコウクジラのミオグロビンの構造解明でした^{[ 89 ]。}ケンドリュー卿はこの功績により、 1962年にマックス・ペルーツと共にノーベル化学賞を受賞しました^{[ 90 ]}。この成功以来、タンパク質、核酸、その他の生体分子のX線結晶構造が19万個決定されています^{[ 91 ]} 。解析された構造数で最も近い競合法は核磁気共鳴（NMR）分光法ですが、その数は結晶構造解析法の10分の1にも満たないのです^{[ 92 ]} 。結晶学は任意の大きさの分子の構造を解明できますが、溶液NMRは比較的小さな分子（1000μm未満）に限定されます。70 kDa ）。X線結晶構造解析は、医薬品がタンパク質標的とどのように相互作用するか、またどのような変化がそれを改善する可能性があるかを決定するために日常的に使用されています。^{[ 93 ]}しかし、内在性膜タンパク質は、単離して可溶化するために界面活性剤やその他の変性剤が必要であり、そのような界面活性剤が結晶化を妨げることが多いため、結晶化は依然として困難です。膜タンパク質はゲノムの大きな構成要素であり、イオンチャネルや受容体など、生理学的に非常に重要な多くのタンパク質が含まれています。^{[ 94 ] [ 95 ]}ヘリウム極低温法は、タンパク質結晶の放射線損傷を軽減するために使用されます。^{[ 96 ]}

X線結晶学の2つの極限的なケース、すなわち「小分子」（連続無機固体を含む）と「高分子」結晶学がよく用いられる。小分子結晶学では、通常、非対称単位に100個未満の原子を含む結晶が対象となる。このような結晶構造は通常、原子が孤立した電子密度の「塊」として識別できるほどよく解像される。対照的に、高分子結晶学では、単位格子に数万個の原子が含まれることが多い。このような結晶構造は一般的に解像度が低く、原子と化学結合は孤立した原子ではなく、電子密度のチューブとして現れる。一般的に、小分子は高分子よりも結晶化しやすいが、結晶学的イメージングと技術の進歩により、数十万個の原子を含むウイルスやタンパク質でもX線結晶学が可能であることが証明されている。^{[ 97 ]}

単結晶X線結晶学の技術には、3つの基本的なステップがあります。最初のステップ（そして多くの場合最も難しいステップ）は、研究対象の材料の適切な結晶を得ることです。結晶は十分に大きく（通常、すべての寸法で0.1 mmより大きい）、組成が純粋で構造が規則的で、亀裂や双晶などの重大な内部欠陥 がない必要があります。^{[ 98 ]}

2 番目のステップでは、結晶を強力な X 線ビーム (通常は単一波長 (単色 X 線)) の中に置くと、規則的な反射パターンが生成されます。回折された X 線の角度と強度が測定され、各化合物は固有の回折パターンを持ちます。^{[ 99 ]}結晶を徐々に回転させると、以前の反射が消え、新しい反射が現れます。結晶のあらゆる方向で、すべてのスポットの強度が記録されます。複数のデータセットを収集する必要がある場合があり、各セットは結晶の完全な回転の 半分強をカバーし、通常は数万の反射を含みます。^{[ 100 ]}

第３段階では、これらのデータは補完的な化学情報と計算的に組み合わされ、結晶内の原子配置のモデルが作成され、改良されます。最終的に改良された原子配置モデル（現在は結晶構造と呼ばれています）は、通常、公開データベースに保存されます。^{[ 101 ]}

結晶学は、不純または不規則な結晶の乱れを特徴づけるために使用できますが、結晶学では一般的に、複雑な原子配列の構造を解明するために、高い規則性を持つ純粋な結晶が必要です。純粋で規則的な結晶は、金属、鉱物、その他の巨視的な材料のサンプルなどの天然または合成材料から得られる場合があります。このような結晶の規則性は、高分子結晶アニーリング^{[ 102 ] [ 103 ] [ 104 ]}などの方法で改善できる場合があります。しかし、多くの場合、回折品質の結晶を得ることが、原子分解能構造を解明する上での主な障壁となります。^{[ 105 ]}

小分子結晶学と高分子結晶学では、回折に適した結晶を作製するために使用できる技術の範囲が異なります。小分子は一般的に立体配座の自由度が少なく、化学気相成長法や再結晶法など、幅広い方法で結晶化できます。一方、高分子は一般的に自由度が多く、安定した構造を維持するように結晶化を行う必要があります。例えば、タンパク質やより大きなRNA分子は、三次構造がほどけてしまうと結晶化できません。そのため、結晶化条件の範囲は、これらの分子が折り畳まれた状態を維持できる溶液条件に限定されます。

タンパク質結晶は、ほとんどの場合、溶液中で成長します。最も一般的な方法は、構成分子の溶解度を非常にゆっくりと低下させることです。これを急激に行うと、分子が溶液から沈殿し、容器の底に役に立たない粉塵や非晶質ゲルが形成されます。溶液中での結晶成長は、2 つのステップで特徴付けられます。まず、微細な結晶子（おそらく 100 個の分子のみを含む）の核形成があり、次にその結晶子が成長し、理想的には回折に適した結晶になります。^{[ 106 ] [ 107 ]}最初のステップ（核形成）を促進する溶液条件は、必ずしも 2 番目のステップ（その後の成長）を促進する条件と同じではありません。溶液条件は、最初のステップ（核形成）を抑制し、2 番目のステップ（成長）を促進するように設定する必要があります。そうすることで、液滴ごとに 1 つの大きな結晶のみが形成されます。核形成が促進されすぎると、1 つの大きな結晶ではなく、液滴内に小さな結晶子が多数形成されます。逆に、核形成が促進されすぎると、結晶は全く形成されません。他のアプローチとしては、油中でタンパク質を結晶化させる方法があり、水性タンパク質溶液を液体油の下に滴下し、油の層を通して水が蒸発する。油の種類によって蒸発透過性が異なるため、異なるタンパク質混合物から濃度変化が生じる。^{[ 108 ]}

整然とした結晶の核生成や成長に適した条件を予測することは困難です。^{[ 109 ]}実際には、好ましい条件はスクリーニングによって特定されます。非常に大量の分子が準備され、さまざまな結晶化溶液がテストされます。^{[ 110 ]}成功する条件を見つけるまでに、通常、数百、場合によっては数千の溶液条件が試されます。さまざまな条件は、分子の溶解度を下げるために1つ以上の物理的メカニズムを使用できます。たとえば、pHを変更するもの、ホフマイスター系列の塩や溶液の誘電率を下げる化学物質を含むもの、さらに、エントロピー効果によって分子を溶液から押し出すポリエチレングリコールなどの大きなポリマーを含むものなどがあります。結晶化を促進するためにいくつかの温度を試したり、溶液が過飽和になるまで徐々に温度を下げたりすることも一般的です。これらの方法は、結晶化させる分子を高濃度で使用するため、大量の目的分子を必要とします。結晶化グレードのタンパク質をそのような大量（ミリグラム単位）入手することが困難であるため、体積が約100ナノリットルの結晶化試験液滴を正確に分注できるロボットが開発されました。これは、手作業でセットアップした結晶化試験（約1マイクロリットル）と比較して、実験あたりに使用されるタンパク質が10分の1になることを意味します。^{[ 111 ]}

結晶化を阻害する要因はいくつか知られています。成長中の結晶は一般的に一定温度に保たれ、結晶化を妨げる可能性のある衝撃や振動から保護されます。分子や結晶化溶液中の不純物は、結晶化を阻害することがよくあります。分子の立体配座の柔軟性も、エントロピーのために結晶化を阻害する傾向があります。規則的ならせん構造に自己組織化する傾向のある分子は、結晶化をしにくいことが多いです。結晶は双晶によって損なわれることがあります。双晶は、単位格子が複数の方向に等しく好ましい状態で充填できる場合に発生します。ただし、最近の計算手法の進歩により、双晶結晶の構造を解明できる可能性があります。目的の分子の結晶化に失敗した場合、結晶学者は分子をわずかに改変したバージョンで再度試みることがあります。分子特性のわずかな変化でも、結晶化挙動に大きな違いが生じる可能性があります。

タンパク質の場合、不純物は結晶成長を促進する場合もあれば、阻害する場合もあることが示されている。可聴音による振動が有効な場合もある。これらの問題は、タンパク質結晶化の特徴である相分離に関連している可能性がある。^{[ 112 ]}

記録された一連の二次元回折パターンは、それぞれ異なる結晶方位に対応しており、三次元セットに変換されます。データ処理は、反射のインデックス付けから始まります。これは、単位格子の寸法と、どのイメージピークが逆格子空間のどの位置に対応するかを特定することを意味します。インデックス付けの副産物として、結晶の対称性、つまり空間群が決定されます。いくつかの空間群は最初から除外できます。たとえば、反射対称性はキラル分子では観察できないため、ほぼ常にキラルであるタンパク質分子では、230 個の可能な空間群のうち 65 個しか許容されません。インデックス付けは、一般的に自動インデックス付けルーチンを使用して実行されます。^{[ 116 ]}対称性が割り当てられると、データは統合されます。これにより、数千の反射を含む数百の画像が、少なくとも各反射のミラー指数と各反射の強度の記録からなる単一のファイルに変換されます（この状態では、ファイルには誤差推定値と部分性（特定の反射のどの部分がその画像に記録されたか）の尺度も含まれることがよくあります）。

完全なデータセットは、結晶の異なる方向で撮影された数百枚の個別の画像で構成される場合があります。これらは、2 枚以上の画像に現れるピークを使用してマージおよびスケーリングして、一貫した強度スケールを持つようにする必要があります。ピークの相対強度は構造を決定する重要な情報であるため、強度スケールを最適化することが重要です。結晶学的データ収集の反復的な手法と結晶材料の高い対称性により、回折計は多くの対称等価反射を複数回記録します。これにより、対称等価反射の測定強度がどれだけ類似しているかに基づく信頼性指標である対称性関連R 因子を計算することができ、^{[ 117 ]}データの品質を評価できます。

各回折「スポット」の強度は、構造因子の絶対値の二乗に比例します。構造因子は、波の振幅と位相の両方に関する情報を含む複素数です。解釈可能な電子密度マップを得るには、振幅と位相の両方を知る必要があります（電子密度マップによって、結晶学者は分子の初期モデルを構築できます）。位相は回折実験中に直接記録することはできません。これは位相問題として知られています。初期位相推定値は、さまざまな方法で得ることができます。

• 第一原理位相決定法または直接法 – これは通常、小さな分子（非水素原子が 1000 個未満）に選択される方法であり、小さなタンパク質の位相問題を解決するために成功裏に使用されてきました。データの分解能が 1.4 Å (140pm) より優れている場合、直接法を使用して位相情報を取得できます。 ^{[ 118 ] [ 119 ]} 
• 分子置換法 – 関連する構造が既知であれば、それを分子置換法の探索モデルとして使用して、単位格子内の分子の配向と位置を決定することができます。このようにして得られた位相は、電子密度マップを作成するために使用できます。 ^{[ 120 ]}
• 異常X線散乱（ MADまたはSAD位相決定） – X線波長を原子の吸収端^{[ a ]}を超えて走査すると、散乱が既知の方法で変化します。3つの異なる波長（吸収端よりはるかに低い波長、はるかに高い波長、および中間波長）で反射の完全なセットを記録することにより、異常に回折する原子のサブ構造、ひいては分子全体の構造を解くことができます。異常散乱原子をタンパク質に組み込む最も一般的な方法は、セレン原子を含むセレノメチオニンが豊富な培地で、メチオニン要求性（メチオニンを合成できない宿主）。その後、吸収端付近で多波長異常分散（MAD）実験を行うと、タンパク質内のメチオニン残基の位置が得られ、初期位相が得られます。 ^{[ 121 ]}
• 重原子法（多重同形置換） – 電子密度の高い金属原子を結晶に導入できる場合、直接法またはパターソン空間法を使用して、それらの位置を決定し、初期位相を取得できます。このような重原子は、結晶を重原子を含む溶液に浸すか、共結晶化（重原子の存在下で結晶を成長させる）によって導入できます。多波長異常分散位相測定と同様に、散乱振幅の変化を解釈して位相を得ることができます。これはタンパク質結晶構造が解明された元の方法ですが、セレノメチオニンを用いた多波長異常分散位相測定にほぼ取って代わられています。^{[ 120 ]}

初期位相が得られたら、初期モデルを構築できます。モデル内の原子位置とそれぞれのデバイ・ウォラー因子（または原子の熱運動を考慮したB因子）は、観測された回折データに適合するように調整され、理想的にはより良い位相セットが得られます。次に、新しいモデルを新しい電子密度マップに適合させ、連続的に調整を行います。この反復プロセスは、回折データとモデル間の相関が最大になるまで続きます。一致度は、次のように定義されるR因子によって測定されます。

${\displaystyle R={\frac {\sum _{\text{すべての反射}}\left|F_{\text{obs}}-F_{\text{calc}}\right|}{\sum _{\text{すべての反射}}\left|F_{\text{obs}}\right|}},}$

ここでFは構造因子です。同様の品質基準としてR_フリーがあり、これは構造精密化に含まれなかった反射のサブセット (約 10%) から計算されます。どちらのR因子もデータの分解能に依存します。経験則として、R_フリーはオングストローム単位の分解能を 10 で割った値にほぼ等しくなります。したがって、2 Å の分解能のデータセットでは、最終的なR_フリー は約 0.2 になります。立体化学、水素結合、結合長と結合角の分布などの化学結合の特徴は、モデルの品質を補完する尺度です。反復的なモデル構築では、位相バイアスまたはモデルバイアスに遭遇することがよくあります。位相推定はモデルから得られるため、計算されたマップの各ラウンドでは、実際に密度が存在するかどうかに関係なく、モデルに密度がある場所に密度が表示される傾向があります。この問題は、最尤重み付けと省略マップを使用したチェックによって軽減できます。^{[ 124 ]}

非対称単位内のすべての原子を観察できるとは限りません。多くの場合、結晶構造の乱れによって電子密度マップがぼやけてしまいます。水素などの散乱力の弱い原子は、通常、観察できません。また、タンパク質の側鎖が複数の（4つ未満の）許容コンフォメーションを持つ場合など、単一の原子が電子密度マップに複数回現れることもあります。さらに、結晶学者が、分子について推定された共有結合構造が誤っていたり、変化していたり​​することに気づく場合もあります。例えば、タンパク質が切断されたり、結晶化前には検出されなかった翻訳後修飾を受けたりするケースです。

結晶構造の精密化における一般的な課題は、結晶学的無秩序に起因する。無秩序はさまざまな形態をとるが、一般的には 2 種またはコンフォメーションの共存を伴う。無秩序を認識しないと、解釈が不正確になる。無秩序の不適切なモデリングによる落とし穴は、結合伸縮異性体の否定された仮説によって示される。^{[ 125 ]} 無秩序は、多くの場合 2 つの成分の相対的な存在量とそれらの同一性に関してモデル化される。大きな分子やイオンの構造では、溶媒と対イオンがしばしば無秩序である。

粉末X線回折データの解析に計算手法を用いる方法は、現在では広く普及している。一般的には、実験データをモデル構造のシミュレーション回折図と比較し、装置パラメータを考慮に入れた上で、最小二乗法に基づく最小化アルゴリズムを用いてモデルの構造パラメータまたは微細構造パラメータを精密化する。相同定と構造精密化を可能にする利用可能なツールのほとんどは、リートベルト法に基づいています^{[ 126 ] [ 127 ]。その中には、FullProf Suite [ 128 ] [ 129 ]}、Jana2006 ^{[ 130 ]} 、 MAUD ^{[ 131 ] [ 132 ] [ 133 ]}、Rietan ^{[ 134 ]}、GSAS ^{[ 135 ]}などのオープンソースの無料ソフトウェアもあれば、Diffrac.Suite TOPAS ^{[ 136 ]} 、 Match! ^{[ 137 ]}などの商用ライセンスで利用できるものもあります。これらのツールのほとんどは、結晶構造自体を考慮せずに、ブラッグピークの位置とピークプロファイルに基づいてセルパラメータを精密化するLe Bail精密化（プロファイルマッチングとも呼ばれる）も可能にします。より新しいツールでは、構造データと微細構造データの両方の改良が可能であり、FullProf Suiteに含まれるFAULTSプログラム^{[ 138 ]}では、平面欠陥（積層欠陥、双晶、共生など）を持つ構造の改良が可能です。

分子構造のモデルが確定すると、多くの場合、ケンブリッジ構造データベース（小分子用）、無機結晶構造データベース（ICSD）（無機化合物用） 、タンパク質データバンク（タンパク質、場合によっては核酸用）などの結晶構造データベースに登録されます。しかし、医薬品として重要なタンパク質を結晶化するための民間企業による商業的な取り組みで得られた構造の多くは、公共の結晶構造データベースには登録されていません。