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タンパク質の核磁気共鳴分光法（通常はタンパク質NMRと略される）は、NMR分光法を用いてタンパク質、核酸、およびそれらの複合体の構造とダイナミクスに関する情報を得る構造生物学の分野である。この分野は、ETHのRichard R. ErnstとKurt Wüthrich [ 1 ]、NIHのAd Bax、Marius Clore、Angela Gronenborn [ 2 ]、ハーバード大学のGerhard Wagnerらによって開拓された。NMR分光法による構造決定は通常、それぞれ高度に専門化された技術セットを使用するいくつかの段階から構成される。サンプルが準備され、測定が行われ、解釈アプローチが適用され、構造が計算され、検証される。
NMRは、原子の中心核（「原子核」）の量子力学的特性を利用します。これらの特性は局所的な分子環境に依存し、その測定によって原子が化学的にどのように結合しているか、空間的にどれだけ近いか、そして互いにどれだけ速く動いているかのマップが得られます。これらの特性は、より馴染みのある磁気共鳴画像法（MRI）で使用されるものと基本的に同じですが、分子レベルでの応用では、ミリメートル（放射線科医が関心を持つスケール）からナノメートル（結合した原子は通常、ナノメートルの数分の1の距離にある）へとスケールが100万倍も変化するため、やや異なるアプローチが用いられます。このスケールの変化には、検出感度と長期測定における安定性が大幅に向上する必要があります。MRIとは対照的に、構造生物学の研究では画像を直接生成するのではなく、複雑なコンピュータ計算によって3次元分子モデルを生成します。
現在、ほとんどのサンプルは水溶液中で検査されていますが、固体サンプルにも対応できる方法が開発されています。データ収集は、サンプルを強力な磁石の中に置き、サンプルを通して無線周波数信号を送信し、その信号の吸収を測定することによって行われます。タンパク質内の原子の環境に応じて、個々の原子の原子核は異なる周波数の無線信号を吸収します。さらに、異なる原子核の吸収信号は、隣接する原子核によって影響を受ける可能性があります。この情報を使用して、原子核間の距離を決定できます。これらの距離は、タンパク質の全体構造を決定するために使用できます。
典型的な研究では、2つのタンパク質がどのように相互作用するかを調べ、その相互作用の正常な生物学的メカニズムを解明するための低分子化合物の開発（「ケミカルバイオロジー」）や、医薬品開発のための有望な候補化合物の探索（創薬）などが目的となる。多くの場合、相互作用するタンパク質のペアは、ヒト遺伝学の研究によって同定されており、その相互作用が好ましくない突然変異によって阻害される可能性を示唆している。また、ショウジョウバエ、酵母、線虫C. elegans、マウスなどの「モデル」生物の正常な生物学的メカニズムにおいて重要な役割を果たしている場合もある。試料を調製するには、通常、分子生物学的手法を用いて、細菌からの組換え発現と精製によってタンパク質を大量生産する。この手法では、分子の同位体組成を変化させることも可能であり、同位体はそれぞれ異なる挙動を示すため、重なり合うNMRシグナルを識別するための方法を提供する上で有用である。
タンパク質核磁気共鳴法は、高純度タンパク質の水溶液サンプルに対して実施されます。通常、サンプル量は300～600マイクロリットルで、タンパク質濃度は0.1～3ミリモルです。タンパク質の供給源は、天然由来のもの、または遺伝子工学による組換えDNA技術を用いた生産システムで生産されたもののいずれでも構いません。組換え発現タンパク質は通常、十分な量を生産しやすく、この方法により同位体標識が可能になります。
タンパク質NMRは、多次元核磁気共鳴実験を利用してタンパク質に関する情報を取得します。理想的には、分子内の各原子核はそれぞれ異なる電子環境を経験し、それによって識別可能な固有の化学シフトを持ちます。しかし、タンパク質のような大きな分子では、共鳴の数は通常数千にも及ぶため、一次元スペクトルでは必然的に偶然の重なりが生じます。そのため、異なる原子核の周波数を相関させる多次元実験が行われます。次元が増えることで重なりの可能性が減り、分子の特定の部分にある原子核からの信号を相関させるため、より多くの情報が得られます。磁化は、電磁（高周波）エネルギーのパルスを使用してサンプルに伝達され、遅延を使用して原子核間に伝達されます。このプロセスは、いわゆるパルスシーケンスで記述されます。パルスシーケンスにより、実験者は原子核間の特定の種類の結合を調査し、選択することができます。タンパク質に用いられる核磁気共鳴実験は、大きく2つのカテゴリーに分類される。1つは化学結合を介して磁化が伝達される実験、もう1つは結合構造に関係なく空間を介して磁化が伝達される実験である。前者は、異なる化学シフトを特定の原子核に割り当てるために用いられ、後者は主に構造計算や非標識タンパク質を用いた割り当てにおいて用いられる距離制約を生成するために用いられる。
試料の濃度、分光計の磁場、および実験の種類によっては、タンパク質試料に対する単一の多次元核磁気共鳴実験では、信号平均化によって適切な信号対雑音比を得るため、また実験の様々な次元を通して磁化移動が十分に進行するまでに、数時間から数日かかる場合がある。他の条件が同じであれば、高次元実験は低次元実験よりも時間がかかる。
通常、同位体標識タンパク質を用いて最初に測定される実験は、2次元異核単量子相関（HSQC）スペクトルです。ここで「異核」とは、1H以外の原子核を指します。理論的には、異核単量子相関は、異核に結合した各H原子につき1つのピークを持ちます。したがって、15N標識タンパク質を用いた15N-HSQCでは、主鎖の環状構造のためアミド水素を持たないプロリンを除き、主鎖の各窒素原子につき1つのシグナルが期待されます。さらに、側鎖に窒素-水素結合を持つ各残基（W、N、Q、R、H、K）も15N-HSQCシグナルに寄与します。15N-HSQCは、各タンパク質が固有のシグナル位置パターンを持つため、しばしばタンパク質の指紋と呼ばれます。 15N-HSQCの解析により、研究者は期待される数のピークが存在するかどうかを評価し、複数のコンフォメーションや試料の不均一性に起因する可能性のある問題を特定することができます。比較的短時間で実施できる異核種単量子相関実験は、その後に行われるより長時間で費用のかかる、より複雑な実験の実施可能性を判断するのに役立ちます。ただし、異核種単量子相関だけでは、ピークを特定の原子に割り当てることはできません。
核磁気共鳴データを解析するためには、タンパク質の共鳴割り当て、すなわちどの化学シフトがどの原子に対応するかを特定することが重要です。これは通常、複数の異なるタイプのNMR実験から得られた情報を用いて、逐次的に調べていくことで達成されます。多くの割り当て実験は炭素13と窒素15に依存するため、具体的な手順はタンパク質が同位体標識されているかどうかによって異なります。
標識されていないタンパク質の場合、通常の手順は、相関分光法(COSY)による一連の二次元同核核磁気共鳴実験を記録することです。相関分光法には、従来の相関分光法、全相関分光法 (TOCSY)、核オーバーハウザー効果分光法 (NOESY) など、いくつかの種類があります。[ 3 ] [ 4 ]二次元核磁気共鳴実験では、二次元スペクトルが生成されます。両軸の単位は化学シフトです。COSY と TOCSY は、隣接するプロトン間の化学結合を介して磁化を伝達します。従来の相関分光実験では、隣接する原子上のプロトン間でのみ磁化を伝達できますが、全相関分光実験では、プロトンが磁化を中継できるため、隣接する原子によって接続されているすべてのプロトン間で磁化が伝達されます。したがって、従来の相関分光法では、アルファプロトンがベータプロトンに磁化を伝達し、ベータプロトンはアルファプロトンとガンマプロトン（存在する場合）に磁化を伝達し、次にガンマプロトンがベータプロトンとデルタプロトンに磁化を伝達し、このプロセスが続きます。全相関分光法では、アルファプロトンと他のすべてのプロトンは、連続したプロトン鎖でつながっている場合、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロンに磁化を伝達することができます。連続したプロトン鎖は、個々のアミノ酸の側鎖です。したがって、これら2つの実験は、いわゆるスピンシステム、つまりペプチドプロトン、アルファプロトン、および各残基の側鎖のすべてのプロトンの化学シフトの共鳴のリストを作成するために使用されます。どの化学シフトがスピンシステムのどの原子核に対応するかは、従来の相関分光法の接続性と、異なる種類のプロトンが特徴的な化学シフトを持つという事実によって決定されます。異なるスピン系を順序立てて関連付けるには、核オーバーハウザー効果分光法（NOESY）実験を用いる必要がある。この実験では磁化が空間を介して伝達されるため、同じスピン系に属するか否かにかかわらず、空間的に近いすべてのプロトンについてクロスピークが現れる。隣接する残基は本質的に空間的に近いため、NOESYにおける他のスピン系とのピークに基づいて割り当てを行うことができる。
同核核磁気共鳴法を用いる際の重要な問題の一つは、ピークの重なりです。これは、異なるプロトンが同じ、あるいは非常に類似した化学シフトを持つ場合に発生します。この問題はタンパク質が大きくなるにつれて深刻になるため、同核核磁気共鳴法は通常、小型のタンパク質やペプチドに限定されます。
最も一般的に行われる 15N 実験は1 H- 15 N HSQC です。この実験は感度が高く、比較的短時間で実施できます。NMR を用いた構造決定のためのタンパク質の適合性の確認や、サンプル条件の最適化によく使用されます。これは、タンパク質の溶液構造の決定に使用される標準的な実験群の 1 つです。HSQC は、15 N-TOCSY-HSQC や15 N-NOESY-HSQC などの 3 次元および 4 次元 NMR 実験にさらに拡張できます。[ 5 ]
タンパク質が炭素-13と窒素-15で標識されている場合、ペプチド結合を介して磁化を伝達し、結合を介して異なるスピン系を接続する三重共鳴実験を記録することが可能です。 [ 6 ] [ 7 ]これは通常、次の実験のいくつかを使用して行われます。HNCO 、 HN (CA)CO }、HNCA、[ 8 ] HN(CO)CA、HNCACB 、およびCBCA(CO)NH。6つの実験はすべて、炭素次元で拡張された1H - 15N平面（HSQCスペクトルに類似）で構成されています。HN (CA)COでは、各H N平面には、その残基のカルボニル炭素と、配列内の前の残基のカルボニル炭素からのピークが含まれます。HNCOには、前の残基からのカルボニル炭素の化学シフトのみが含まれますが、 HN(CA)COよりもはるかに感度が高いです。これらの実験では、各1 H- 15 N ピークを前のカルボニル炭素にリンクさせることができ、各スピンシステムの自身の炭素と前の炭素のシフトを一致させることで、連続的な割り当てを行うことができます。HNCAとHN (CO)CA は、カルボニルではなくアルファ炭素 (C α ) を使用する点を除いて同様に機能し、 HNCACBとCBCA(CO)NH はアルファ炭素とベータ炭素 (C β )の両方を含みます。通常、炭素次元での重なりを解消するには、これらの実験を複数回行う必要があります。この手順は、結合移動に基づいているため、通常、NOESY ベースの方法よりも曖昧さが少なくなります。NOESY ベースの方法では、空間的に近いが連続する残基に属さない原子に対応する追加のピークが現れ、割り当てプロセスが混乱します。最初の連続共鳴割り当ての後、通常は、追加の炭素次元で分解されたTOCSY実験であるHCCH-TOCSYなどの実験を使用して、 CαとCβから側鎖の残りの部分への割り当てを拡張することが可能です。
構造計算を行うためには、実験的に決定された多数の拘束条件を生成する必要がある。これらはいくつかのカテゴリーに分類されるが、最も広く用いられているのは距離拘束条件と角度拘束条件である。
NOESY実験におけるクロスピークは、対象となる2つの原子核間の空間的な近接性を示します。したがって、各ピークは原子核間の最大距離に変換でき、通常は1.8～6オングストロームの範囲です。NOESYピークの強度は距離のマイナス6乗に比例するため、距離はピークの強度に基づいて決定されます。強度と距離の関係は厳密には一致しないため、通常は距離の範囲が用いられます。
化学シフトに基づいて、NOESY ピークを正しい原子核に割り当てることは非常に重要です。タンパク質には通常、数千の NOESY ピークがあるため、この作業を手動で行うと、通常は非常に手間がかかります。統合 NMR プラットフォーム [ 19 ] の PASD [ 9 ] [ 10 ] / XPLOR-NIH、[ 11 ] [ 12 ] UNIO、[ 13 ] CYANA、[ 14 ] ARIA [ 15 ] / CNS、[ 16 ]および AUDANA [ 17 ] / PONDEROSA-C/S [ 18 ]などのコンピュータ プログラムでは、手動で前処理されたピーク位置とピークボリュームのリストに対して、構造計算と連携してこの作業を自動的に実行します。反復的に精緻化されたピークリストを必要とする煩雑な操作なしに生の NOESY データに直接アクセスできるのは、今のところXPLOR-NIHに実装されている PASD [ 10 ]アルゴリズム[ 11 ]、UNIO ソフトウェアパッケージに実装されている ATNOS/CANDID アプローチ[ 13 ]、および PONDEROSA-C/S のみであり、これにより客観的かつ効率的な NOESY スペクトル分析が保証されます。
可能な限り正確な帰属を得るためには、炭素13および窒素15のNOESY実験を利用できることが非常に有利です。これらの実験は、プロトン次元における重なりを解消するのに役立つからです。これにより、より迅速かつ信頼性の高い帰属が可能になり、ひいてはより精度の高い構造決定につながります。
距離拘束に加えて、化学結合のねじれ角（典型的にはψ角とφ角）に対する拘束も生成できます。1つの方法は、カルプラス方程式を使用して、結合定数から角度拘束を生成することです。もう1つの方法は、化学シフトを使用して角度拘束を生成することです。どちらの方法も、α炭素周辺の幾何構造が結合定数と化学シフトに影響を与えるという事実を利用しており、結合定数または化学シフトが与えられれば、ねじれ角について適切な推測を行うことができます。
試料中の分析対象分子は、試料条件を操作することで、分光計の外部磁場に対して部分的に秩序づけることができる。一般的な手法としては、試料にバクテリオファージやバイセルを添加すること、あるいは試料を延伸ポリアクリルアミドゲルで調製することなどが挙げられる。これにより、非球形分子の特定の配向を優先する局所的な環境が作られる。通常、溶液NMRでは、分子の高速回転のため、核間の双極子結合は平均化される。ある配向がわずかに過剰に存在するため、残留双極子結合が観測される。双極子結合は固体NMRで一般的に使用され、単一のグローバル参照フレームに対する結合ベクトルの相対的な配向に関する情報を提供する。通常、NHベクトルの配向はHSQCのような実験で調べられる。当初、残留双極子結合は以前に決定された構造の精密化に使用されていたが、de novo構造決定の試みも行われている。[ 20 ]
NMR分光法は原子核特異性を持つため、水素と重水素を区別できます。タンパク質中のアミドプロトンは溶媒と容易に交換し、溶媒に異なる同位体（通常は重水素）が含まれている場合、 NMR分光法によってその反応をモニターできます。特定のアミドがどれだけ速く交換されるかは、その溶媒へのアクセス可能性を反映しています。したがって、アミド交換速度は、タンパク質のどの部分が埋もれているか、水素結合しているかなどの情報を提供します。一般的な応用例として、遊離型と複合体の交換を比較することが挙げられます。複合体で保護されるアミドは、相互作用界面にあると想定されます。
実験的に決定された制約は、構造計算プロセスの入力として使用できます。研究者は、XPLOR-NIH [ 11 ] CYANA、 GeNMR 、またはRosettaNMR [ 21 ]などのコンピュータ プログラムを使用して、結合長や角度などのタンパク質の一般的な特性に加えて、可能な限り多くの制約を満たそうとします。アルゴリズムは、制約と一般的なタンパク質の特性をエネルギー項に変換し、このエネルギーを最小化しようとします。このプロセスにより、データが特定の折り畳みを決定するのに十分であれば収束する構造のアンサンブルが得られます。
得られた構造の集合は「実験モデル」、つまり特定の種類の実験データの表現です。この事実を認識することは重要です。なぜなら、モデルがその実験データの良い表現である場合もあれば、悪い表現である場合もあるからです。[ 22 ]一般に、モデルの品質は、モデルを生成するために使用される実験データの量と質、およびそのようなデータの正しい解釈の両方に依存します。
あらゆる実験には誤差が伴います。ランダム誤差は、得られる構造の再現性と精度に影響を与えます。誤差が系統誤差である場合は、モデルの精度に影響が出ます。精度は測定の再現性の度合いを示し、多くの場合、同じ条件下で測定されたデータセットの分散として表されます。一方、正確度は、測定値が「真の」値にどれだけ近づいているかを示します。
理想的には、タンパク質のモデルは、それが表す実際の分子によく適合するほど正確になり、原子の位置に関する不確実性が少ないほど精度が高くなります。実際には、タンパク質のモデルを比較するための「標準分子」は存在しないため、モデルの精度は、モデルと一連の実験データとの一致度によって決まります。歴史的に、NMRによって決定された構造は、一般的に、X線回折によって決定された構造よりも品質が低いものでした。これは、NMRによって得られたデータに含まれる情報量が少ないことが一因です。このため、同じタンパク質について、X線回折によって決定された固有のコンフォメーションと比較することによって、NMRアンサンブルの品質を確立することが一般的になっています。しかし、X線回折構造が存在しない可能性があり、溶液中のタンパク質は柔軟な分子であるため、単一の構造で表されるタンパク質は、タンパク質の原子位置の固有の変動を過小評価することにつながる可能性があります。 NMRやX線結晶構造解析によって決定された一連の立体配座は、単一の立体配座よりもタンパク質の実験データをよりよく表す可能性がある。[ 23 ]
モデルの有用性は、少なくとも部分的には、モデルの正確さと精度によって決まります。精度は比較的低いものの正確なモデルは、一連のタンパク質の構造間の進化的な関係を研究するのに役立つ可能性がありますが、合理的な薬剤設計には、正確かつ精密なモデルの両方が必要です。精度の程度に関わらず、正確でないモデルはあまり役に立ちません。[ 22 ] [ 24 ]
タンパク質構造は誤差を含む可能性のある実験モデルであるため、これらの誤差を検出できることが非常に重要です。誤差の検出を目的としたプロセスは検証と呼ばれます。構造を検証する方法はいくつかあり、PROCHECKやWHAT IFのように統計的なものもあれば、 CheShiftのように物理的な原理に基づくもの、あるいはPSVSのように統計と物理の原理を組み合わせたものもあります。
構造に加えて、核磁気共鳴はタンパク質のさまざまな部分のダイナミクスに関する情報も得ることができます。これは通常、T 1や T 2などの緩和時間を測定して、秩序パラメーター、相関時間、化学交換速度を決定することを含みます。NMR 緩和は、分子内の局所的な変動磁場の結果です。局所的な変動磁場は、分子運動によって生成されます。このように、緩和時間の測定は、原子レベルでの分子内の運動に関する情報を提供できます。タンパク質のダイナミクスの NMR 研究では、窒素 15同位体が研究に好ましい原子核です。これは、その緩和時間が分子運動と比較的簡単に関連付けられるためです。ただし、これにはタンパク質の同位体標識が必要です。T 1および T 2緩和時間は、さまざまなタイプのHSQCベースの実験を使用して測定できます。検出できる運動の種類は、約 10 ピコ秒から約 10 ナノ秒の時間スケールで発生する運動です。さらに、約 10 マイクロ秒から 100 ミリ秒の時間スケールで起こるより遅い動きも研究できます。ただし、窒素原子は主にタンパク質の主鎖に存在するため、結果は主にタンパク質分子の中で最も剛性の高い部分である主鎖の動きを反映します。したがって、窒素 15緩和測定から得られた結果は、タンパク質全体を代表するものではない可能性があります。そのため、タンパク質のアミノ酸側鎖の動きを体系的に研究できる炭素 13と重水素の緩和測定を利用する技術が最近開発されました。ペプチドと全長タンパク質のダイナミクスと柔軟性に関する研究の困難で特殊なケースは、無秩序構造です。今日では、タンパク質は無秩序または構造の欠如として知られるより柔軟な挙動を示すことができるという概念が受け入れられています。ただし、タンパク質の完全な機能状態を表す静的な画像ではなく、構造のアンサンブルを記述することができます。この分野では、特に新しいパルスシーケンス、技術の改良、そしてこの分野の研究者に対する厳格な訓練といった点で、多くの進歩が見られます。
従来、核磁気共鳴分光法は比較的小さなタンパク質またはタンパク質ドメインに限定されていました。これは、より大きなタンパク質で重なり合うピークを分離することが困難であることに一部起因しますが、同位体標識と多次元実験の導入により、この問題は軽減されています。もう 1 つのより深刻な問題は、大きなタンパク質では磁化の緩和が速く、信号を検出する時間が短くなることです。その結果、ピークは幅広くなり弱くなり、最終的には消失します。緩和を減衰させるために 2 つの技術が導入されました。横緩和最適化分光法(TROSY) [ 25 ]とタンパク質の重水素化[ 26 ]です。これらの技術を使用することで、900 kDa のシャペロンGroES - GroELと複合体を形成したタンパク質を研究することが可能になりました。[ 27 ] [ 28 ]
NMRによる構造決定は従来、高度な訓練を受けた科学者によるデータの対話型解析を必要とする時間のかかるプロセスでした。構造決定のスループットを向上させ、タンパク質NMRを非専門家でも利用できるようにするために、このプロセスを自動化することに大きな関心が寄せられています（構造ゲノミクスを参照）。最も時間のかかるプロセスは、配列特異的共鳴割り当て（主鎖および側鎖の割り当て）とNOE割り当ての2つです。NMR構造決定プロセス全体の個々の部分を自動化することを目的とした、いくつかの異なるコンピュータプログラムが発表されています。最も進歩が見られたのは、NOE割り当ての自動化です。これまでのところ、人間の介入なしにタンパク質NMR構造決定プロセス全体を自動化して実行することを提案したのは、FLYAとUNIOアプローチのみです。[ 13 ] [ 14 ] NMRFAM-SPARKYのモジュール、例えば APES (2 文字コード: ae)、I-PINE/PINE-SPARKY (2 文字コード: ep; I-PINE ウェブサーバー)、PONDEROSA (2 文字コード: c3, up; PONDEROSA ウェブサーバー) は統合されており、各ステップで視覚的検証機能を備えた完全な自動化を提供します。[ 29 ]また、構造計算プロトコルを標準化して、より迅速かつ自動化に適したものにするための取り組みも行われています。[ 30 ]最近、上記のプログラムの後継であるPOKYスイートがリリースされ、最新の GUI ツールと AI/ML 機能を提供しています。[ 31 ]
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