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イングランド王ジェームズ1世の治世（1603年～1625年）には、エリザベス女王の治世（1558年～1603年）に始まったピューリタン運動がイングランドでさらに高まり、イングランド国教会の権威との衝突が続いた。これは最終的に、17世紀のチャールズ1世の治世（1625年～1649年）において、聖公会信徒とピューリタンのさらなる疎遠化につながり、イングランド内戦（1642年～1651年）、ピューリタンの護国卿オリバー・クロムウェルの短い統治（1653年～1658年）、イングランド共和国（1649年～1660年）を経て、今日すべての英語圏諸国で祝われている政治的、宗教的、市民的自由へと至った。
ジェームズ王は、ジョージ・ブキャナンなどの厳格なスコットランド・カルヴァン主義の家庭教師の影響下でスコットランドで育ち、スコットランドにおけるプロテスタント運動への献身を彼に植え付けようとした。イングランドとスコットランド両国の王となったジェームズは、イングランド国教会をエリザベス女王時代に確立された監督制と自身の君主制の支配下に厳密に置こうとした。ジェームズ王は王権神授説を強く信じており、このテーマに関する著書も執筆している。そのため、彼はピューリタン運動の重要な側面、特にピューリタンの会衆派や長老派の教会統治観の多くを抑圧し続けた。しかし、国王はイングランドにおけるプロテスタントの体制を強化し、国の繁栄と成功のあらゆる面においてピューリタンの存在が必要であることを理解していた。そのため、ジェームズ王は、エリザベス女王と同様に、ピューリタンの牧師、学者、紳士階級の多くを支援し、昇進させた。ただし、彼らが主教の権威の下で英国国教会と協力する意思がある場合に限る。このため、ピューリタン運動はジェームズ王の治世下でイングランド全土で著しい成長と拡大を続けた。確かに、イングランドのピューリタン運動は、ジェームズ王の下で仕えた3人のカンタベリー大主教の交代によって著しく強化された。エリザベス女王によって任命されたジョン・ウィットギフト大主教（1583-1604）はピューリタン運動を抑圧しようとした。ジェームズ王訳聖書の制作を監督したリチャード・バンクロフト大主教（1604-1610）もピューリタン改革運動を抑圧しようとしたが、カトリックの脅威のために次第に彼らに頼らざるを得なくなった。ジョージ・アボット大司教（1611年～1633年）は、実際にはピューリタンとその改革構想をしばしば支持し、彼らを高位の聖職者や学者に任命した。そのため、アボットはしばしば「ピューリタンの大司教」と呼ばれた。
ジェームズ王の治世中にピューリタンと英国国教会が共同で成し遂げた最大の功績の一つは、欽定訳聖書（1611年）の翻訳であり、これは西洋世界における歴史的、文学的、神学的偉業の一つと言えるでしょう。また、ジェームズ王の治世中には、ピューリタンと英国国教会がドルト会議（1618～1619年）で協力し、改革派神学者による国際会議で、カルヴァン主義の五原則を擁護し、アルミニウス主義の異端を論駁するドルト信条を起草しました。さらに、ジェームズ王の治世中には、改革派教会内のピルグリム運動が英国国教会から分離し、ウィリアム・ブラッドフォードとウィリアム・ブリュースターの指導の下、プリマス植民地（1620年）として知られるアメリカへの植民地化事業を開始しました。ジェームズ王治世下のイングランドにおけるピューリタン運動のこうした偉大な業績は、当時のピューリタニズムの影響力がどれほど広範に及んでいたか、そして彼らが国王の権威に様々な形で適応していったかを示している。エマニュエル・カレッジの学長ウィリアム・パーキンスのように、体制内部で活動しようとした者もいれば、ウィリアム・エイムズのようにイングランド国教会を離れ、他の地へと活動の場を移した者もいた。エイムズは生涯の多くをオランダで過ごした。
エリザベス女王の治世に始まり、ジェームズ王の治世中にイングランドで勢力と影響力を増したイングランドのピューリタン運動は、イングランド国教会の改革を推進し、国内におけるローマ・カトリックの影響力を排除するとともに、聖書と改革派神学に厳密に準拠した統一プロテスタント信仰のもとで、イングランド王室とイングランド国民の国益を促進することを目指した。エリザベス朝時代に始まったこのピューリタンの構想は、最終的にウェストミンスター会議、そしてウェストミンスター信仰告白、小教理問答、大教理問答、公の礼拝の指針を含むウェストミンスター基準へと結実した。
イングランド王ジェームズ1世の治世下では、ピューリタン運動は、一般的に受け入れられていた監督制プロテスタント宗教の形態において、正統派のイングランド国教会と共存していた。この均衡は、この時期の終わりに、ドルト会議による教義上の変化、三十年戦争勃発直後のスペインとの婚姻に関する議論による政治上の変化、そしてカルヴァン主義からの部分的な見解の変化といった、教会内部のいくつかの新たな展開によって崩れた。ジェームズ王の宗教問題の解決を受け入れなかった分離派は、イングランドだけでなくオランダからもニューイングランド植民地へ移住し始めた。
エリザベス1世は1603年3月に亡くなり、スコットランド王ジェームズ6世が後を継いだ。ジェームズは1567年に母メアリー女王が退位して以来（当時ジェームズは1歳だった） 、スコットランド王であった。ジェームズは母とはほとんど交流がなく、スコットランド長老派教会の保護者に育てられた。ジョン・ノックスは1560年からスコットランド宗教改革を主導しており、スコットランド教会は概ねピューリタンがイングランドで望んでいた教会の形態に似ていた。1599年の著書『バシリコン・ドロン』の中で、国王はピューリタンに対して厳しい言葉を投げかけたが、その批判は最も過激なピューリタンに向けられたもののように思われ、国王は穏健な改革には同意するだろうと思われた。
1603年を通して、ピューリタンの牧師たちは、1,000人のピューリタン牧師が署名したことから「千年請願」として知られる請願書への署名を集めた。この請願書は、イングランド国教会における王権の優位性に異議を唱えないよう慎重に配慮し、カトリック的と見なされる儀式を廃止するための教会改革を数多く求めた。千年請願書は、ジェームズ王が司教たちと条件について話し合うことができないよう、レスターでジェームズ王に提出された。
請願書は、各教区に説教牧師を任命すべきだと主張した（単に共通祈祷書から礼拝を読み上げるだけの牧師ではなく）。ジョン・ウィットギフト大主教の、聖職者は共通祈祷書と祭服の着用を義務付けるという方針に反対し、請願書は、牧師は三十九箇条と国王至上権のみを遵守すればよいと主張した。最後に、請願書は監督制の廃止と、長老制による教会統治制度の確立を求めた。
神学を研究し、神学的な論点について議論することを楽しんでいたジェームズ1世は、千年祭請願の支持者と反対者が教会の改革の是非について議論できる会議をハンプトン・コート宮殿で開催することに同意した。ペストの流行により延期された後、ハンプトン・コート会議は1604年1月に開催された。国王はピューリタンの代表として、ジョン・レイノルズ（オックスフォード大学コーパス・クリスティ・カレッジ学長）、ローレンス・チャダートン（ケンブリッジ大学エマニュエル・カレッジ学長）、トーマス・スパーク、ジョン・ニュースタブスの4人のピューリタンを選んだ。ホイットギフト大主教は、ピューリタンに反対する8人の司教（ホイットギフトの弟子であるロンドン司教リチャード・バンクロフトを含む）、7人の司祭長、および他の2人の聖職者からなる代表団を率いた。
1月14日に開催された会議の最初の会合で、ジェームズはホイットギフト大主教の一派とだけ会った。2日目の1月16日、彼はピューリタンと会ったが、この日の会議は、レイノルズがイングランドに長老制を創設するというピューリタンの提案に言及したことで、ピューリタンにとって悪い結果に終わった。ジェームズは、司教を長老制に置き換えるという提案を、教会における自分の権力を弱めようとする試みとみなした。そのため、ジェームズはこの機会に「司教がいなければ王はいない！」という有名な格言を発し、その日の会議を早めに切り上げた。1月18日、国王はまずホイットギフトの一派と教会法学者の集まりと会った後、ピューリタンを呼び出して判決を聞かせた。ジェームズは、共通祈祷書の使用は継続されるべきであると宣言し、説教奉仕については何も規定しなかった。しかし、彼は共通祈祷書のいくつかの変更を承認した。1) 助産婦による洗礼の記述を削除する。2) 「赦免」という用語（ピューリタンがカトリックの懺悔の秘跡と関連付けていたが、プロテスタントはこれを拒否していた）を「罪の赦免」という用語に置き換える。3) 堅信礼をカトリックの秘跡の意味から切り離すために「按手」と改名する。4) その他いくつかの小さな変更。ジェームズはまた、聖書の新しい公認翻訳のためのピューリタンの計画を支持することに同意したと発表し、1611年に出版された欽定訳聖書の作成への道筋をつけた。
ジョン・ウィットギフトの死後、ジェームズはリチャード・バンクロフトをカンタベリー大主教の後任に選んだ。バンクロフトはハンプトン・コート会議でピューリタンに反対しており、彼の選出は改革の終焉を告げるものとなった。選出後まもなく、バンクロフトはイングランド聖職者会議に教会法典を提出した。この教会法典は国王の承認を得て、イングランド国教会の教会法の一部となった。1559年に共通祈祷書を承認する統一法を可決したイングランド議会は、新たな教会法を制定する権限を持つのは議会であり、聖職者会議ではないと主張した。ピューリタンは、司教たちが議会の犠牲の上に自らの権力を拡大しようとしていると反論した。最終的に、ジェームズは議会の要求を受け入れ、教会法典を撤回した。 1604年の議会は、ピューリタンが司教派に対抗して議会派と同盟を結んだ最初の事例となった。その後数十年にわたり、この同盟はイギリス政治における最も顕著な特徴の一つとなり、1640年代のイングランド内戦における分裂の基盤を形成することになる。
火薬陰謀事件の発覚は、特に激しい反カトリック主義の時代をもたらした。ピューリタンはカトリック教徒に対して強硬な姿勢をとっていたため、この時代には一定の支持を得ていた。しかしながら、彼らの改革案はバンクロフトによって阻止されてしまった。
1610年にバンクロフト大司教が死去すると、ジェームズはジョージ・アボットを後継者に選んだ。ジェームズはスコットランド教会に司教制度（スコットランド宗教改革の際に廃止されていた）を復活させたが、他の地域の司教ほどの権限はなく、実質的には長老会の常任議長としての役割を果たした。1608年、アボットはイングランドとスコットランドの教会を統一しようとするジェームズの取り組みの一環として、初代ダンバー伯ジョージ・ホームに同行してスコットランドを訪れ、ジェームズに感銘を与えた。ジェームズは1609年にアボットをリッチフィールド司教に任命していた。ジェームズは、アボットをカンタベリー大司教に任命することで、イングランドとスコットランドの教会を統一するという自身の計画をさらに推し進めようとしたのである。
マシュー・パーカー以降のカンタベリー大主教は皆カルヴァン主義者であったが、アボットは一般的に「カルヴァン主義の大主教」あるいは「ピューリタンの大主教」とさえ見なされており、ピューリタンがカンタベリー大主教から自分たちの提案への支持を得ることに最も近づいた人物である。（アボットが明らかにピューリタンと異なる立場をとった唯一の問題は、監督制の問題であった。アボットはイングランド国教会における使徒継承の教義を最も声高に主張した人物の一人であった。）
1611年、1604年に始まったキング・ジェームズ版または公認版の英語聖書が出版されました。これは基本的に英国国教会の公式な著作でしたが、翻訳には多くのピューリタンが貢献しました。最初に印刷したのは国王の印刷官ロバート・バーカーで、英国教会当局によって承認された3番目の英語訳でした。最初のものはヘンリー8世の治世（1535年）に委嘱されたグレート・バイブル、2番目はエリザベス1世の治世（1568年）に委嘱されたビショップス・バイブルでした。1604年1月、ジェームズ1世はハンプトン・コート会議を招集し、そこで、ジュネーブ聖書を好んだピューリタンが認識していた以前の翻訳の問題点に対応するために、新しい英語訳が構想されました。キング・ジェームズ版は、ピューリタンの間でジュネーブ聖書が占めていた地位を徐々に奪っていきました。欽定訳聖書（KJV）は「荘厳な文体」で知られ、英語圏文化において最も重要な書物の一つであり、英語圏世界の形成における原動力であったと評されている。
イングランドでは、日曜日の午前中はキリスト教の礼拝に充て、午後はスポーツやゲームを楽しむのが長らく習慣だった。ピューリタンたちは、安息日にスポーツをすることは第四戒に違反するとして、日曜日のスポーツに強く反対した。彼らの安息日厳守の立場は、他のヨーロッパの改革派教会よりもはるかに強固なものとなった。
17世紀初頭、ピューリタンはいくつかの地域で勢力を拡大し、日曜日のスポーツを禁止することに成功した。1617年、ランカシャーでは、日曜日のスポーツをめぐってピューリタンと地元の郷紳（その多くはカトリック教徒だった）の間で激しい論争が繰り広げられた。チェスター司教のトーマス・モートンは、自身の教区で巻き起こった論争を受けて、日曜日のスポーツの是非について国王に裁定を求めた。
これに対し、ジェームズ王は「スポーツの書」を発布し、日曜日に一部のスポーツを行うことは合法だが、他のスポーツは違法であると宣言した。「ピューリタンや厳格な人々」の意見を批判したこの書は、日曜日に許容されるスポーツとして、アーチェリー、ダンス、「跳躍、跳馬、その他無害な娯楽」を挙げた。熊いじめ、牛いじめ、「幕間劇」、ボウリングは禁止された。国王はすべての英国国教会の聖職者に「スポーツの書」を会衆に読み聞かせるよう命じたが、アボット大主教はこれに反論し、聖職者に「スポーツの書」を読み聞かせないよう命じた。
1618年、ジェームズ王はスコットランド教会にイングランドの慣習を課す「パースの五条項」を提案した。この五条項では以下のことが求められた。
パース五条項は最終的にスコットランド教会総会で承認されたが、かなりの数のスコットランド長老派教徒が反対した。イングランドのピューリタンたちにとって、パース五条項は間違った方向に向かっているように見えた。
1620年、今日ピルグリムとして知られるピューリタン分離派の一団が、メイフラワー号に乗って大西洋を横断し、プリマス植民地を建設するという有名な航海に出ました。彼らは総督ウィリアム・ブラッドフォードと教会の長老ウィリアム・ブリュースターに率いられていました。ピルグリムはもともとイングランドのピューリタン分離派運動の一部でした。彼らはノッティンガムシャー州イースト・レトフォード近郊のスクルービーというイングランドの村にいた頃から、宗教的迫害の圧力を感じ始めていました。1607年、トビアス・マシュー大司教は家々を襲撃し、数人の信徒を投獄しました。そのため、信徒たちは1609年にイングランドを離れ、オランダに移住し、最初はアムステルダム、次にライデンに定住しました。ライデンでは信徒たちは自由に信仰を実践することができましたが、オランダ社会は彼らにとって馴染みのないものでした。そこで彼らはアメリカに新たな植民地を建設する準備を始めたのです。プリマス植民地の最初の入植地はニュープリマスで、そこはジョン・スミス船長によって以前に測量され、命名された場所でした。この入植地は植民地の首都として機能し、現在のマサチューセッツ州プリマス市へと発展しました。最盛期には、プリマス植民地は現在のマサチューセッツ州の南東部の大部分を占めていました。ジェームズタウンやバージニアの他の入植地と並んで、北アメリカでイギリス人が設立した最も初期の成功した植民地の1つであり、ニューイングランド地方で最初の大規模な恒久的イギリス人入植地でした。植民地はマサソイト酋長との条約を締結することができ、これが成功を確実なものにするのに役立ちました。この条約締結には、パトゥクセト族の一員であるスクアントの支援がありました。1691年までに、プリマス植民地とピルグリム入植者は、最終的にジョン・ウィンスロップ率いるピューリタンのマサチューセッツ湾植民地（1628年設立）や他の領土と合併し、マサチューセッツ湾植民地を形成しました。
ジェームズ王は自らをヨーロッパの平和構築者と見なし、プロパガンダでは彼を現代のソロモン王になぞらえた。宗教においては、イングランド国教会が模範的な中間地点となり得ると考え、カトリック教徒もプロテスタントも、イングランド国教会を模範とした教会を受け入れることができると考えた。
この点において、彼はイングランド国教会がプロテスタントとカトリックの中間の道、つまり中道であるという理論を支持していた。息子のチャールズが結婚できる年齢になると、ジェームズはチャールズをカトリックの王女と結婚させることを考えた。 1618年に三十年戦争が勃発し、イングランドのプロテスタントは、義理の息子であるプファルツ選帝侯フリードリヒ5世のためにジェームズに介入を要求した。ジェームズは当初拒否したが、1620年にフリードリヒのために遠征を支援する資金を調達するために議会を招集せざるを得なくなった。これは、1614年の混乱議会以来、ジェームズが招集した最初の議会であった。エドワード・コークが率いる議会は、国王が息子がプロテスタントと結婚することに同意しない限り、この遠征に十分な資金を与えることを拒否した。ジェームズは、議会は王権の問題に干渉する権利はないと答えた。議会は抗議を可決し、古来からの権利を主張した。ジェームズは、寵臣である初代バッキンガム公ジョージ・ヴィリアーズとスペイン大使である初代ゴンドマール伯ディエゴ・サルミエント・デ・アクーニャの勧めに従い、この抗議文を記録簿から破り捨て、議会を解散した。
バッキンガム公は、ジェームズ王だけでなくチャールズ王子に対しても相当な影響力を行使していた。1623年、彼は23歳のチャールズ王子に、イングランドはスペインと同盟を結び、チャールズ王子はスペイン王女と結婚すべきだと説得した。こうして二人はスペインへ渡り、チャールズ王子はスペイン王フェリペ3世の娘、マリア・アンナ王女に求婚した。この結婚は歴史上「スペイン婚」として知られている。スペイン婚はイングランドのプロテスタントの間で非常に不評で、ピューリタンの陰謀論に大きな信憑性を与えた。ピューリタンたちは、スペイン婚はイングランドをカトリックに戻すための陰謀の一部だと主張した。1623年にジェームズ王が再び議会を招集した際、反カトリックの反発は非常に激しく、議会が国王の要求に一切同意しないことは明らかだった。一方、スペインでは、チャールズ王子がカトリックに改宗し、スペインで1年間カトリックの教えを受けることに同意すれば、スペイン婚に同意すると主張した。こうした状況下で、チャールズは最終的に1624年のスペインとの結婚を辞退した。彼のイングランドへの帰国は盛大に祝われ、国民の祝日として扱われた。
スペインに拒絶されたことを受け、チャールズはフランスとの同盟とスペインとの戦争を支持するようになった。ピューリタンが多数を占める1624年の議会では、スペインとの婚姻を強く支持していた大臣、初代ミドルセックス伯ライオネル・クランフィールドが弾劾された 。議会は原則としてスペインとの戦争資金を拠出することに同意したが、実際に戦争資金を割り当てることはなかった。
ジェームズ王は生涯カルヴァン主義の教義を信奉しており、1609年に神学者ヤコブス・アルミニウスが死去した後、オランダ共和国で五項論争が勃発した際、アルミニウス主義のレモンストラント派に対抗してカルヴァン主義のゴマリスト派を支持した。ジェームズは1618年のドルト会議に派遣される英国代表を自ら選び、会議の結果に同意した。しかし、ジェームズは（スポーツの書、パースの五条項、スペインの試合などをめぐって）ピューリタンの反対にますます直面するようになり、エキュメニカルな教会計画をより支持してくれる聖職者を探し始めた。エリザベス女王の治世以来、イングランドにはテオドール・ベザが提唱しピューリタンが受け入れた高位カルヴァン主義の極端な予定説に反対する神学者が数多く存在していた。例えば、ケンブリッジ大学のレディ・マーガレット神学教授であったピーター・バロは、 1595年にウィットギフト大主教がカルヴァン主義のランベス条項をイングランド国教会に押し付けようとした試みに反対した。ケンブリッジにおけるバロの弟子たち、特にランスロット・アンドリュース、ジョン・オーバーオール、サミュエル・ハースネットらは、アルミニウスが提唱したのとほぼ同等の用語で、バロの予定説批判を繰り返した。ジェームズが反ピューリタンの同盟者を探していたとき、彼はこの一派が協力してくれることを発見した。この一派のメンバーでアルミニウスの立場を全面的に受け入れた者はほとんどいなかったものの、彼らはすぐにピューリタンたちから「アルミニウス派」と呼ばれるようになった。
1624年、それまで無名だったケンブリッジ大学の学者リチャード・モンタギューが、王室の許可を得て『A New Gagg for an Old Goose』（古いガチョウのための新しいガチョウ）を出版した。この本は、イングランド国教会に対するカトリックの批判への反論として書かれた。モンタギューは、批判されたカルヴァン主義の立場はイングランド国教会内の少数派のピューリタンにしか当てはまらず、イングランド国教会の聖職者の大多数は高位カルヴァン主義を拒否していると主張した。『A New Gagg』はピューリタンの歴史において非常に重要な意味を持つ。なぜなら、彼らが（適切な実践の問題ではなく）教義上の立場と結びつけられた最初の事例となったからである。例えば、ドルト会議にイングランド代表として出席したチチェスター司教ジョージ・カールトンは、自分の教義上の立場がピューリタニズムと同一視されていることに衝撃を受けた。
1625年のジェームズ王の治世末期までに、ピューリタニズムはイングランドにおいて革命的な宗教的・政治的運動として確立された。ピューリタンはイングランド社会のあらゆる制度に影響力を及ぼし、オランダやプリマス植民地といったアメリカ大陸の植民地にも勢力を広げた。さらに、ピューリタンはイングランド議会の大部分を支配するに至った。ピューリタン運動はチャールズ1世の治世下でさらに勢力を拡大し、イングランド内戦後にはイングランド共和国とオリバー・クロムウェルの護国卿政権下で一時的にイングランドを支配するに至った。しかし、ピューリタン運動が大きな勢いを得たのは、間違いなくジェームズ王の治世（1604年～1625年）下であった。
ジェームズ王の治世において、イングランドにおけるピューリタン運動の発展に貢献したピューリタンの牧師や神学者は数多くいた。中でも特に傑出した貢献者には以下のような人物がいる。