染色

顕微鏡検査で一般的に使用される染料のほとんどは、BSC 認証染色液として入手可能です。これは、製造元のバッチのサンプルが独立機関である生物学的染色委員会( BSC )によってテストされ、純度、染料含有量、染色技術の性能に関する特定の基準を満たしているか、それを上回っていることが確認されたことを意味します。これにより、より正確な実験とより信頼性の高い結果が保証されます。これらの基準は、委員会のジャーナルBiotechnic & Histochemistryに掲載されています。^{[ 3 ]}多くの染料は、供給元によって組成が異なります。BSC 認証染色液を使用することで、予期しない結果の原因を排除できます。^{[ 4 ]}

一部の業者は、生物学的染色委員会ではなく、自社で「認証」した染色剤を販売しています。そのような製品は、診断やその他の用途に適している場合もあれば、適していない場合もあります。^{[ 5 ]}

細菌の染色方法として、陽性染色法が失敗した場合でも通常は成功する簡単な方法として、陰性染色法があります。これは、サンプルをスライドに塗り広げ、ニグロシン（黒色の合成染料）またはインドインク（炭素粒子の水性懸濁液）を塗布することで実現できます。乾燥後、微生物は明視野顕微鏡で、周囲の暗い環境とよくコントラストをなす明るい封入体として観察できます。^{[ 6 ]} 陰性染色では、微生物の細胞壁は通常負の電荷を帯びており、負に帯電した染料を反発するため、微生物ではなく背景を染色することができます。陰性染色で使用される染料は酸性です。^{[ 1 ]}注：陰性染色は微生物を破壊しない穏やかな手法であるため、病原体の研究には適していません。

ネガティブ染色とは異なり、ポジティブ染色では塩基性染料を用いて標本を明るい背景に対して着色します。発色団はネガティブ染色とポジティブ染色の両方で同様に使用されますが、この手法で使用される発色団は負電荷ではなく正電荷を帯びたイオンです。多くの微生物の負電荷を帯びた細胞壁は正電荷を帯びた発色団を引き付け、標本が染色液を吸収して染色液の色になります。微生物学では、ネガティブ染色よりもポジティブ染色の方が一般的に使用されています。さまざまな種類のポジティブ染色を以下に示します。^{[ 1 ]}

単純染色法は、スライド上で一度に 1 種類の染色剤のみを使用する手法です。染色剤が 1 種類しか使用されないため、標本 (陽性染色の場合) または背景 (陰性染色の場合) は 1 色になります。したがって、単純染色法は通常、スライド 1 枚につき 1 つの生物のみを観察するために使用されます。鑑別染色法は、スライド 1 枚につき複数の染色剤を使用します。使用する染色剤に基づいて、異なる特性を持つ生物は異なる色で表示され、複数の標本を分類することができます。鑑別染色法は、内生胞子染色で見られるように、 1 つの生物内の異なる細胞小器官を染色するためにも使用できます。^{[ 1 ]}

グラム染色法は、グラムの状態を判定し、細菌を細胞壁の構成に基づいて大まかに分類するために使用されます。グラム染色法では、クリスタルバイオレットで細胞壁を染色し、ヨウ素（媒染剤として）、フクシンまたはサフラニンで対比染色して（すべての細菌をマークします）。グラムの状態は、細菌の標本を、一般的にその基礎となる系統発生を代表する2つのグループに分けるのに役立ちます。この特性は、他の技術と組み合わせることで、臨床微生物学検査室で有用なツールとなり、適切な抗生物質の早期選択において重要となる場合があります。^{[ 8 ]}

ほとんどのグラム染色標本では、グラム陰性菌は対比染色によって赤色またはピンク色に染まります。脂質含有量が高いため、アルコール処理後に細胞壁の多孔性が増し、CVI複合体（クリスタルバイオレット-ヨウ素）が通過できるようになります。そのため、一次染色液は保持されません。さらに、ほとんどのグラム陽性菌とは異なり、グラム陰性菌はペプチドグリカン層が数層しかなく、二次細胞膜は主にリポ多糖で構成されています。

内生胞子染色法は、細菌の殺菌を非常に困難にする内生胞子の有無を識別するために用いられます。細菌胞子は水性色素試薬を透過しないため、染色が困難であることがわかっています。内生胞子染色法は、クロストリジオイデス・ディフィシルなどの内生胞子形成細菌病原体の識別に特に有用です。より効率的な方法が開発される以前は、この染色は熱固定と対比染色を用いたヴィルツ法で行われていました。マラカイトグリーンと希釈したカルボルフクシンを使用し、オスミウム酸で細菌を固定することで、色素の混ざり合いを防ぐことができました。しかし、新たに改良された染色法により、これらの染色の作成にかかる時間が大幅に短縮されました。この改良には、カルボルフクシンを水性サフラニンに置き換え、新たに希釈した5%マラカイトグリーン製剤と組み合わせることが含まれています。この新しく改良された染色液は、以前と同様に熱固定、すすぎ、拭き取り乾燥を行い、後で検査した。検査すると、内生胞子形成細菌はすべて緑色に染色され、他のすべての細胞は赤色に見える。^{[ 9 ]}

チール・ネールゼン染色は、グラム染色などの標準的な検査室染色法では染色されない結核菌種を染色するために用いられる抗酸性染色法である。

この染色法は、細菌を染色する赤色のカルボルフクシンと、メチレンブルーなどの対比染色剤の両方を用いて行われます。

ヘマトキシリンとエオジン染色法は、組織学において薄い組織切片を検査するためによく用いられます。 ^{[ 10 ]}ヘマトキシリンは細胞核を青く染色し、エオジンは細胞質、結合組織、その他の細胞外物質をピンクまたは赤く染色します。^{[ 10 ]} エオジンは赤血球に強く吸収され、赤血球を鮮やかな赤色に染めます。熟練したH&E標本では、赤血球はほぼオレンジ色になり、コラーゲンと細胞質（特に筋肉）はさまざまなピンク色になります。

パパニコロウ染色、またはPAP染色は、染色時間とコストを削減しつつ品質を損なうことなく、穿刺吸引細胞診（FNAC）に代わるものとして開発されました。この染色法は、さまざまな臓器のさまざまな組織タイプの細胞サンプルを検査するために頻繁に使用される方法です。PAP染色は、FNACの「適切な代替法」となるために、いくつかの改良が加えられてきました。この変化は、科学者が、空気乾燥させたロマノフスキー染色標本の不透明な外観とは対照的に、核の構造を保存する湿潤固定標本を高く評価したことに端を発しています。これにより、湿潤固定と空気乾燥を組み合わせたハイブリッド染色法である超高速パパニコロウ染色が開発されました。この改良法には、細胞の透明度を高めるために細胞を再水和する生理食塩水の使用と、核の色を強調するためのアルコール性ホルマリンの使用が含まれます。パパニコロウ染色法は、形態学的品質の向上、染色時間の短縮、およびコストの削減により、現在ではすべての臓器タイプの細胞学的染色法の代わりに使用されています。これは、パップスメア標本の染色によく使用されます。^{[ 11 ]}ヘマトキシリン、オレンジG、エオシンY、ライトグリーンSFイエロー、および場合によってはビスマルクブラウンYの組み合わせを使用します。^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]}

^{[ 13 ]}過ヨウ素酸シッフ炭水化物（グリコーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンを染色するために使用される組織学の特殊染色法です。PAS染色は、グリコーゲンが沈着する肝臓組織によく用いられ、グリコーゲン蓄積症のさまざまなタイプを区別するために行われます。PAS染色は、内分泌系の卵巣や膵臓の腫瘍、および腎臓系の膀胱や腎臓に見られるグリコーゲン顆粒を検出できるため重要です。基底膜もPAS染色で検出されることがあり、腎疾患の診断において重要となる場合があります。菌糸や酵母型の真菌の細胞壁には大量の炭水化物が含まれているため、過ヨウ素酸シッフ染色は、人体の組織サンプル内でこれらの種を特定するのに役立ちます。

マッソンの三色染色法は（その名の通り）3色染色法です。この染色法は、マッソンの原法から様々な用途に合わせて改良されてきましたが、いずれも細胞を周囲の結合組織から区別するのに適しています。ほとんどの染色法では、ケラチンと筋線維は赤色、コラーゲンと骨は青色または緑色、細胞質は淡赤色またはピンク色、細胞核は黒色に染色されます。

ロマノフスキー染色は多色染色効果と考えられており、エオシンプラス（化学的に還元されたエオシン）と脱メチル化メチレンブルー（酸化生成物であるアズールAとアズールBを含む）の組み合わせに基づいています。この染色では、すべての細胞構造に対してさまざまな色が発現するため（「ロマノフスキー・ギムザ効果」）、好中球多形核白血球や細胞核の染色に用いられました。一般的な変法としては、ライト染色、ジェンナー染色、メイ・グリュンワルド染色、ライシュマン染色、ギムザ染色などがあります。

これらは全て、血液や骨髄のサンプルを検査するために使用されます。白血球の種類を容易に区別できるため、血液細胞の検査にはH&E染色よりも好まれます。また、マラリアなどの血液媒介寄生虫を検出するための血液検査にも適しています。^{[ 14 ]}

銀染色とは、組織切片を銀で染色する方法です。この染色法は、タンパク質（例えばIII型コラーゲン）やDNAの検出に重要です。細胞内外の物質を可視化するために用いられます。また、銀染色は温度勾配ゲル電気泳動にも利用されます。

アルゲンタフィン細胞は、ホルマリン固定後に銀溶液を金属銀に還元します。この方法は、イタリアのカミッロ・ゴルジによって、硝酸銀と二クロム酸カリウムの反応を利用して、一部の細胞内でクロム酸銀を沈殿させることで発見されました（ゴルジ法を参照）。銀親和性細胞は、還元剤を含む染色剤に曝露された後、銀溶液を金属銀に還元します。その例としては、ヒドロキノンやホルマリンが挙げられます。

スーダン染色では、スーダン色素を用いてスーダン親和性物質（脂質など）を染色します。スーダンIII、スーダンIV、オイルレッドO、四酸化オスミウム、スーダンブラックBなどがよく用いられます。スーダン染色は、脂肪便の診断において便中の脂肪量を測定するためによく用いられます。

ヴィルツ・コンクリン染色法は、マラカイトグリーン色素を主染色剤として、サフラニンを対比染色剤として用いて、真性内生胞子を染色するために考案された特殊な染色法です。一度染色されると、脱色しません。染色過程における加熱は、大きな要因となります。^{[ 15 ]}加熱によって胞子の膜が開き、色素が内部に入り込むことができます。この染色法の主な目的は、細菌胞子の発芽を示すことです。発芽過程が進行している場合、胞子はマラカイトグリーンによって緑色に変化し、周囲の細胞はサフラニンによって赤色になります。この染色法は、細菌細胞内の胞子の向き、すなわち末端（先端）、亜末端（細胞内）、または中央（細胞の中央）のいずれであるかを判断するのにも役立ちます。

コラーゲンハイブリダイゼーションペプチド（CHP）染色法は、酵素的、機械的、化学的、または熱的手段によって損傷または分解されたかどうかに関わらず、あらゆるタイプの変性コラーゲン（I型、II型、IV型など）を簡単かつ直接的に染色できる方法です。CHPは、組織内の既存の一本鎖コラーゲンと折り畳まれて三重らせん構造を形成することで機能します。CHPは、単純な蛍光顕微鏡で観察できます。

アクリジンオレンジ（AO）は、核酸選択性の蛍光カチオン性色素で、細胞周期の判定に有用です。細胞透過性があり、DNAやRNAとインターカレーションまたは静電引力によって相互作用します。DNAに結合すると、スペクトル的にフルオレセインと非常によく似ています。フルオレセインと同様に、固形組織サンプルの表面にある従来の染色細胞をバックライトで照らすための非特異的染色剤としても有用です（蛍光バックライト染色^{[ 16 ]}）。

^{[ 17 ]}ビスマルクブラウンムチンを黄色に、肥満細胞を濃い茶色に染色します。この染色の欠点の1つは、周囲の他の構造を覆い隠し、コントラストの質を低下させることです。 有用にするには、他の染色と組み合わせて使用​​する必要があります。ビスマルクブラウンと併用される補完的な染色としては、ヘマトキシリンとトルイジンブルーがあり、これらは組織学的サンプル内でより良いコントラストを提供します。

カルミンはグリコーゲンを染色するために使用される鮮やかな赤色の染料であり、カルミンミョウバンは核染色剤である。カルミン染色には媒染剤（通常はアルミニウム）の使用が必要である。

クマシーブリリアントブルーは、タンパク質を非特異的に強い青色に染色する。ゲル電気泳動によく用いられる。

クレシルバイオレットは、神経細胞の細胞質に含まれる酸性成分、特にニッスル小体を紫色に染色する。脳研究でよく用いられる。

クリスタルバイオレットは、適切な媒染剤と組み合わせると、細胞壁を紫色に染色する。クリスタルバイオレットはグラム染色に用いられる染色剤である。

DAPIは蛍光核染色剤で、紫外線で励起され、 DNAに結合すると強い青色蛍光を発します。DAPIは染色体のA=Tリッチリピートに結合します。DAPIは通常の透過型顕微鏡では見えません。生細胞または固定細胞に使用できます。DAPI染色された細胞は、特に細胞数のカウントに適しています。^{[ 18 ]}

エオシンは、ヘマトキシリンの対比染色剤として最もよく使用され、細胞質、細胞膜、および一部の細胞外構造にピンク色または赤色を与えます。また、赤血球に強い赤色を与えます。エオシンは、グラム染色の一部の変法や、他の多くのプロトコルでも対比染色剤として使用されることがあります。実際には、エオシンと呼ばれる非常によく似た化合物が2つあります。最もよく使用されるのはエオシンY（エオシンY wsまたはエオシンイエローとも呼ばれる）で、わずかに黄色みを帯びています。もう1つのエオシン化合物はエオシンB（エオシンブルーまたはインペリアルレッド）で、非常に淡い青みを帯びています。2つの色素は互換性があり、どちらを使用するかは好みと慣習の問題です。

臭化エチジウムはDNAにインターカレーションして染色し、赤橙色の蛍光を発します。健康な細胞は染色されませんが、アポトーシスの最終段階にある細胞を識別するために使用できます。このような細胞は細胞膜の透過性が非常に高いためです。そのため、臭化エチジウムは細胞集団におけるアポトーシスのマーカーとして、またゲル電気泳動におけるDNAバンドの位置特定によく使用されます。この染色剤は、生存細胞数の計測においてアクリジンオレンジ（AO）と併用することもできます。このEB/AO混合染色では、生細胞は緑色に蛍光を発し、アポトーシス細胞は特徴的な赤橙色の蛍光を維持します。

酸性フクシンは、コラーゲン、平滑筋、またはミトコンドリアの染色に使用できます。酸性フクシンは、マロリーのトリクローム染色法において核および細胞質の染色剤として使用されます。酸性フクシンは、マッソンのトリクローム染色法のいくつかの変法において細胞質を染色します。ファン・ギーソンのピクロフクシン染色法では、酸性フクシンはコラーゲン線維に赤色を与えます。酸性フクシンは、ミトコンドリアの伝統的な染色剤でもあります（アルトマン法）。

ヘマトキシリン（北米ではヘマトキシリン）は核染色剤である。^{[ 10 ]} 媒染剤と併用すると、ヘマトキシリンは核を青紫色または褐色に染色する。^{[ 10 ]}組織学で最も一般的な手順の1つであるH&E染色（ヘマトキシリン・エオジン染色） では、エオジンと併用されることが最も多い。^{[ 10 ]}

ヘキストは、 DNAのマイナーグルーブに結合するビスベンズイミダゾール誘導体化合物です。DNA染色用の蛍光顕微鏡検査でよく用いられるヘキスト染色剤は、水溶液に溶解すると黄色に見え、紫外線励起下では青色の光を発します。ヘキストには、ヘキスト33258とヘキスト33342の2つの主要な種類があります。これら2つの化合物は機能的には類似していますが、構造に若干の違いがあります。ヘキスト33258は末端にヒドロキシル基を持つため、水溶液への溶解性が高いですが、この特性により細胞膜透過性が低下します。一方、ヘキスト33342は末端のヒドロキシル基にエチル基（すなわちエチルエーテル基）が置換されているため疎水性が高く、細胞膜を通過しやすくなっています。

ヨウ素は化学においてデンプンの指示薬として用いられます。デンプンとヨウ素を溶液中で混合すると、濃い青色を呈し、デンプンとヨウ素の複合体を形成します。デンプンはほとんどの植物細胞に共通する物質であるため、弱いヨウ素溶液でも細胞内のデンプンを染色します。ヨウ素は、微生物学で用いられるグラム染色法の構成要素の一つです。グラム染色において媒染剤として用いられるヨウ素は、細胞壁／細胞膜に存在する孔を通して色素が浸透するのを促進します。

ルゴール液、またはルゴールヨウ素液（IKI）は、デンプンが存在すると黒色に変化する褐色の溶液で、細胞染色剤として使用でき、細胞核をより見やすくする。

ルゴール液は、一般的な酢（酢酸）とともに使用され、生検の準備として行われる「パップテスト」のフォローアップ検査中に、子宮頸部および膣組織の前癌病変および癌病変を識別するために使用されます。酢酸により異常細胞は白く変色し、正常組織はヨウ素によりマホガニーブラウンに染色されます。^{[ 19 ]}

マラカイトグリーン（ダイヤモンドグリーンBまたはビクトリアグリーンBとも呼ばれる）は、細菌の染色法であるヒメネス染色において、サフラニンの対比染色剤として青緑色で使用できる。また、胞子を直接染色するためにも使用できる。

メチルグリーンは、明視野顕微鏡や蛍光顕微鏡^{[ 20 ]}で一般的に使用され、細胞のクロマチンを染色して観察しやすくします。

メチレンブルーは、ヒトの頬細胞などの動物細胞を染色し、核をより観察しやすくするために使用されます。また、細胞診における血液塗抹標本の染色にも使用されます。

ニュートラルレッド（またはトルエンレッド）はニッスル液を赤く染色します。通常は他の染料と組み合わせて対比染色剤として使用されます。

ナイルブルー（またはナイルブルーA）は核を青く染色する。生細胞にも使用できる。

ナイルレッド（ナイルブルーオキサゾンとも呼ばれる）は、ナイルブルーを硫酸で煮沸することによって生成されます。これにより、ナイルレッドとナイルブルーの混合物が生成されます。ナイルレッドは親油性染色剤であり、細胞内の脂質球に蓄積して細胞を赤く染色します。ナイルレッドは生細胞にも使用できます。脂質に分配されると強く蛍光を発しますが、水溶液中ではほとんど蛍光を発しません。

四酸化オスミウムは、光学顕微鏡において脂質を染色するために用いられる。脂肪に溶解し、有機物によって還元されて単体オスミウムとなる。単体オスミウムは容易に視認できる黒色の物質である。

ヨウ化プロピジウムは、細胞染色に用いられる蛍光性インターカレーション剤です。フローサイトメトリーでは、細胞生存率や細胞周期解析におけるDNA含有量を評価するためのDNA染色剤として、また顕微鏡観察では核やその他のDNA含有細胞小器官を可視化するために用いられます。ヨウ化プロピジウムは生細胞の細胞膜を透過できないため、壊死細胞、アポトーシス細胞、および正常細胞を区別するのに役立ちます。また、ヨウ化プロピジウムはRNAにも結合するため、RNA染色とDNA染色を区別するにはヌクレアーゼ処理が必要です。

ローダミンは、蛍光顕微鏡検査で一般的に使用される、タンパク質特異的な蛍光染色剤である。

サフラニン（またはサフラニンO）は赤色の陽イオン性染料です。核（DNA）や、軟骨や肥満細胞のグリコサミノグリカン、植物組織のリグニンや色素体の成分など、他の組織ポリアニオンに結合します。 ^{[ 21 ]} サフラニンは、動物（ヒトを含む）組織の核や細胞質に他の染料によって与えられる青色や赤色と対比させるために、コラーゲンに黄色を与える方法で使用される高価な天然染料であるサフランと混同してはいけません。

「サフラニン」という誤った綴りがよく使われています。サフラニンOはアミンなので、語尾に-ineを付けるのが適切です。^{[ 4 ] [ 22 ] [ 23 ]}

SYBR Safe、SYBR Green、SYBR Gold 、Pico Green、SYTO-16、SYTO-9、TOPhBuなどのチアゾールオレンジ誘導体は、蛍光DNAセンサーとして一般的に使用される特殊なシアニン色素です。低濃度でのDNA検出能力は、絶対蛍光増強（AFE）と相対蛍光増強（RFE）の2つの指標を使用して評価されました。^{[ 24 ]}

^{[ 31 ]}リンタングステン酸ウイルス、神経、多糖類の一般的な陰性染色剤。主に0.5～2%のpHで中性に調整され、水と混ぜて水溶液にします。リンタングステン酸は電子密度の高い物質で満たされており、標本を取り囲む背景を暗く染め、標本自体は明るく染めます。このプロセスは、標本が暗く、背景が明るいままになる通常の陽性染色法とは異なります。

四酸化オスミウムは、光学顕微鏡で脂質を染色するために用いられます。脂肪に溶解し、有機物によって還元されて、容易に視認できる黒色の物質である単体オスミウムになります。電子を吸収する重金属であるため、生物学的電子顕微鏡における形態観察に最も一般的に用いられる染色剤の一つと言えるでしょう。また、透過型電子顕微鏡（TEM）による形態観察において、様々なポリマーの染色にも用いられます。₄は非常に揮発性が高く、極めて毒性が強い。オスミウムの酸化数は+8であるため、強力な酸化剤である。多くの物質を激しく酸化し、より低い酸化状態の不揮発性オスミウムの沈殿物を残す。

四酸化ルテニウムは、四酸化オスミウムと同等の揮発性を持ち、さらに腐食性が高く、ポリエチレンなどオスミウムによる着色に耐性のある素材でさえも着色する可能性がある。

電子顕微鏡染色に使用されるその他の化学物質には、 モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カドミウム、カルボヒドラジド、塩化第二鉄、ヘキサミン、三塩化インジウム、硝酸ランタン(III)、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛(II)、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、プロテイン酸銀、クロロ金酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、硫酸バナジルなどがあります。