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グラム染色（グラム染色法またはグラム法）は、細菌種をグラム陽性菌とグラム陰性菌の2つの大きなグループに分類するために使用される染色法です。また、真菌感染症の診断にも使用されることがあります。[ 1 ]この名称は、1884年にこの技術を開発したデンマークの細菌学者ハンス・クリスチャン・グラムに由来します。 [ 2 ]
グラム染色では、細菌の細胞壁の化学的および物理的性質によって細菌を区別します。グラム陽性細胞は、細胞壁に厚いペプチドグリカン層があり、これが主染色剤であるクリスタルバイオレットを保持します。グラム陰性細胞は、ペプチドグリカン層が薄いため、エタノールを加えるとクリスタルバイオレットが洗い流されます。これらの細胞は、対比染色剤（一般的にはサフラニンまたはフクシン）によってピンク色または赤色に染色されます。[ 3 ]クリスタルバイオレットを加えた後には必ずルゴール液が加えられ、クリスタルバイオレットと安定した複合体を形成して染色剤と細胞壁との結合を強化します。[ 4 ]
グラム染色法は、細菌群の同定においてほぼ常に最初のステップとなる。グラム染色法は臨床現場と研究現場の両方で有用な診断ツールであるが、すべての細菌をこの方法で明確に分類できるわけではない。そのため、グラム染色性が可変な細菌群とグラム染色性が不確定な細菌群が存在する。
この方法は、 1884年にベルリン市立病院の霊安室でカール・フリードレンダーと共に働いていた際にこの技術を開発したデンマークの科学者ハンス・クリスチャン・グラム（1853～1938）にちなんで名付けられました。グラムは、ある種類の細菌を別の種類の細菌と区別するためではなく、染色された肺組織の切片で細菌をより見やすくするためにこの技術を考案しました。[ 5 ]グラムは、一部の細菌細胞が脱色に対して顕著な抵抗性を持っていることに気づきました。これらの観察に基づいて、グラムは最初のグラム染色手順を開発し、最初はエーリッヒのアニリンゲンチアナバイオレット、ルゴールのヨウ素、脱色用の絶対アルコール、対比染色用のビスマルクブラウンを使用しました。[ 6 ]彼は1884年にこの方法を発表し、短い報告書の中でチフス菌が染色を保持しないという観察を含めました。 [ 7 ]グラムは当初、自身の方法を用いてグラム陰性菌とグラム陽性菌を区別していなかった。[ 6 ]
グラム染色法は、細菌の細胞壁の物理的特性に基づいて細菌種をグラム陽性菌とグラム陰性菌の2つの大きなグループに分類するために使用される細菌学の実験室技術である[ 8 ]。[ 9 ]グラム染色法は、真菌感染症の 診断にも使用できる[ 1 ]。グラム染色法は、古細菌の分類には使用されない。なぜなら、これらの微生物は系統発生グループに従わない非常に多様な反応を示すからである[ 10 ]。
グラム染色は、感染が疑われる場合に体液または生検組織に対して行われます。グラム染色は培養よりもはるかに早く結果が得られ、感染が患者の治療と予後に大きな違いをもたらす場合に特に重要です。例としては、髄膜炎の脳脊髄液や化膿性関節炎の滑液などがあります。[ 11 ] [ 12 ]
グラム陽性菌は、ペプチドグリカンでできた厚い網目状の細胞壁（細胞膜の50～90%）を持つため、クリスタルバイオレットで紫色に染色されます。一方、グラム陰性菌は細胞膜が薄いため（細胞膜の10%）、紫色の染色液を保持せず、サフラニンでピンク色に染色されます。グラム染色には、以下の4つの基本的な手順があります。
クリスタルバイオレット（CV）は水溶液中でCV +に解離する塩化物（Cl −CV +イオン。これらのイオンはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方の細胞壁を透過します。イオンは細菌細胞の負に帯電した成分と相互作用し、細胞を紫色に染める。[ 15 ]
ヨウ化物（I −またはI − 3 )はCV +と相互作用するそして、細胞の内層と外層にクリスタルバイオレットとヨウ素（CV-I）の大きな複合体を形成する。ヨウ素は媒染剤と呼ばれることが多いが、CV-I複合体の除去を阻害する捕捉剤であり、そのため細胞を着色する。[ 16 ]
アルコールやアセトンなどの脱色剤を加えると、細胞膜の脂質と相互作用します。[ 17 ]グラム陰性細胞は外側のリポ多糖膜を失い、内側のペプチドグリカン層が露出します。CV-I複合体は外膜とともにグラム陰性細胞から洗い流されます。[ 18 ]一方、グラム陽性細胞はエタノール処理によって脱水されます。大きなCV-I複合体は、ペプチドグリカンの多層構造のため、グラム陽性細胞内に閉じ込められます。[ 18 ]脱色ステップは重要であり、適切なタイミングで行う必要があります。脱色剤を長時間（数秒程度）放置すると、グラム陽性細胞とグラム陰性細胞の両方からクリスタルバイオレット染色が除去されます。[ 19 ]
脱色後、グラム陽性細胞は紫色のままで、グラム陰性細胞は紫色を失います。[ 19 ]対比染色（通常は正電荷を持つサフラニンまたは塩基性フクシン）は、脱色されたグラム陰性細菌にピンク色または赤色を与えるために最後に適用されます。[ 3 ] [ 20 ]グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方が対比染色を取り込みますが、グラム陽性細菌では、より濃いクリスタルバイオレット染色のため、対比染色は見えません。
グラム陽性細菌は一般的に、厚いペプチドグリカンに囲まれた単一の膜（単層膜）を持つ。この規則は、バチルス門（モリクテス綱とネガティビクテス綱を除く）と放線菌門の2つの門で適用される。[ 9 ] [ 21 ]対照的に、クロロフレクソタ（緑色非硫黄細菌）のメンバーは単層膜であるが、ペプチドグリカンが薄いか存在しない（デハロコッコイデス綱）ため、陰性、陽性、または判定不能に染色される。デイノコッコタのメンバーは陽性に染色されるが、厚いペプチドグリカンを持つ二層膜である。[ 9 ] [ 21 ]
細胞壁の強度は、ペプチドグリカン内に埋め込まれた糖ポリマー物質であるテイコ酸によって強化されます。テイコ酸は、細胞の正味の負電荷の生成、細胞壁の剛性と形状の維持への寄与、細胞分裂の補助、熱や塩分を含むさまざまなストレス要因に対する耐性など、複数の役割を果たします。ペプチドグリカン層は密度が高いにもかかわらず、比較的多孔質であるため、ほとんどの物質が透過できます。より大きな栄養素については、グラム陽性細菌は細胞外に分泌される外酵素を利用して、細胞外で高分子を分解します。[ 22 ]
歴史的に、グラム陽性菌はフィルミクテス門を構成しており、 この名称は現在最大のグループに使用されています。フィルミクテス門には、ラクトバチルス属、バチルス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属など、多くのよく知られた属が含まれます。[ 23 ]また、細胞壁を持たないためグラム染色できないが、グラム陽性菌から派生したマイコプラズマ属やサーモプラズマ属などの細菌であるモリクテス門も含まれるように拡張されています。 [ 24 ]
一部の細菌は、染色液を保持するのに特に優れた細胞壁を持っています。これらの細菌は、他のグラム陽性細菌とは近縁ではないにもかかわらず、グラム染色で陽性を示します。これらは抗酸性細菌と呼ばれ、特別な染色手順によってのみ他のグラム陽性細菌と区別できます。[ 25 ]
グラム陰性細菌は一般的に、2 つの膜の間に薄いペプチドグリカン層 (二重膜) を持っています。[ 26 ]リポ多糖(LPS) は、ほとんどのグラム陰性細菌の細胞表面で最も豊富な抗原であり、大腸菌やサルモネラ菌の外膜の最大 80% を占めています。[ 27 ]これらの LPS 分子は、O 抗原または O 多糖、コア多糖、および脂質 A から構成され、細胞の負電荷に寄与したり、特定の化学物質から保護したりするなど、複数の機能を果たします。LPS の役割は宿主と病原体の相互作用において重要であり、O 抗原は免疫応答を引き起こし、脂質 A はエンドトキシンとして作用します。[ 22 ]
さらに、外膜は選択的バリアとして機能し、特定の分子を通過させる孔を形成する膜貫通タンパク質であるポリンによって制御されています。細胞膜と外膜の間の空間はペリプラズムとして知られており、栄養素処理のためのペリプラズム酵素が含まれています。ペプチドグリカン層と外膜を連結する重要な構造成分はブラウンリポタンパク質であり、細菌の細胞壁にさらなる安定性と強度を与えます。[ 22 ]
ほとんどの細菌門はグラム陰性であり、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、およびほとんどのシュードモナス門が含まれます（例外として、リケッチア目の一部のメンバーと腸内細菌目の昆虫内共生細菌があります）。[ 9 ] [ 21 ]
グラム染色で染色された細菌の中には、グラム染色が不規則なパターンを示すものがあり、ピンク色と紫色の細胞が混在しているのが見られる。[ 18 ] [ 28 ]バチルス属、ブチリビブリオ属、クロストリジウム属の培養では、増殖中のペプチドグリカン厚の減少は、グラム陰性に染色される細胞数の増加と一致する。[ 28 ]さらに、グラム染色で染色されたすべての細菌において、培養物の経過日数が染色結果に影響を与える可能性がある。[ 28 ]
グラム不確定細菌はグラム染色に対して予測可能な反応を示さないため、グラム陽性またはグラム陰性のいずれであるかを判定することができません。例としては、Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosisなど、多くのMycobacterium属の種が挙げられます。後者の 2 つは、それぞれハンセン病と結核の原因菌です。[ 29 ] [ 30 ] Mycoplasma属の細菌は細胞膜の周りに細胞壁を持たないため、[ 11 ]グラム染色法では染色されず、細胞壁合成を標的とする抗生物質に対して耐性があります。[ 31 ] [ 32 ]
グラム染色という用語は、ハンス・クリスチャン・グラムの姓に由来します。そのため、科学用語の慣例に従い、エポニム（グラム）は大文字で表記されますが、普通名詞（染色）は小文字で表記されます。 [ 33 ]エポニム形容詞であるグラム陽性およびグラム陰性の頭文字は、文書作成を規定するスタイルガイド（ある場合）に応じて、大文字のGまたは小文字のgのいずれかになります。小文字スタイルは、米国疾病予防管理センターやAMAスタイルなどの他のスタイル規定で使用されています。[ 34 ]辞書では、小文字、[ 35 ] [ 36 ]大文字、[ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]または両方を使用する場合があります。[ 41 ] [ 42 ]大文字のグラム陽性またはグラム陰性の使用は、多くの科学雑誌の記事や出版物でもよく見られます。[ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]論文がジャーナルに投稿される際、各ジャーナルはポストプリント版にハウススタイルを適用する場合と適用しない場合があります。プレプリント版には、著者がたまたま使用したスタイルが含まれます。グラム陽性およびグラム陰性の形容詞に小文字を使用するスタイル規則であっても、グラム染色には通常大文字が使用されます。
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