胞子染色

胞子染色は、細菌学において細菌サンプル中の胞子の存在を識別するために使用される技術である。 ^[1]細菌内で胞子は、高温などの極端な条件に耐えるために使用される保護構造であり、化学物質に対する耐性が非常に高い。^{[2]胞子にはATPがほとんど含まれていないかまったく含まれていないため、休眠状態にあることが分かる。胞子は}ケラチンでできた丈夫な外被を含み、核DNAやその他の適応から胞子を保護している。胞子は栄養細胞に再発芽することができ、これが保護特性をもたらし、単純染色やグラム染色などの通常の技術では染色が困難である。胞子染色の特別な技術には、シェーファー・フルトン染色とモーラー染色がある。

胞子は1876年に科学者のコーンとコッホによって初めて研究されました。^[3]胞子はメチレンブルー、サフラニン、カルボルフクシンなどの単純な染料では染色できないことがわかりました。これらの科学者は、他の数人とともに、胞子が休眠状態にあり、熱に耐性があることを発見しました。1900年代初頭、研究者はこれらの胞子による病気や感染を改善する代替方法を見つけようとしていました。^[3]

1922年、ドーナーは胞子を染色する方法を発表しました。彼は胞子が緑色に、栄養細胞がピンクがかった赤色に見える差別染色法を発見しました。^[4]ドーナーはプロセスのステップとして熱を使用しましたが、時間がかかるため、1933年にシェーファーとフルトンが彼の方法を修正しました。

シェーファーとフルトンはブンゼンバーナーを使用することで加熱プロセスを大幅に高速化しました。この方法は最も効果的ではありませんでしたが、ドルナーの方法よりもはるかに便利でした。この改良された方法により、より迅速かつ簡単なテストが可能になり、胞子が染料に対してより敏感になりました。^[4]今日でも、シェーファー・フルトン染色は細菌の特定に役立てるために行われています。

胞子は乾燥や凍結などのさまざまな厳しい条件下で数十年も生き続けることができます。これは胞子内のDNAが長期間生き残ることができるためです。ほとんどの細菌は耐性が高いため胞子を形成できませんが、一般的な種としてはバチルス属（100種以上）とクロストリジウム属（160種以上）があります。^[2]

• 炭疽病を引き起こす炭疽菌^[5]
• セレウス菌- 嘔吐性食中毒と下痢性食中毒の2種類の食中毒を引き起こす可能性がある^[2]
• 枯草菌- 土壌中に生息^[5]
• 破傷風菌- 破傷風や硬直性麻痺を引き起こす胞子。
• ボツリヌス菌- 適切に缶詰にされていない食品に見られる胞子。ボツリヌス菌はボトックスとして販売されることもあり、神経伝達を阻害します。
• クロストリディオイデス・ディフィシル-大腸に炎症を引き起こします。他の抗生物質が原因であることが多いです。症状には下痢、腹痛、発熱などがあります。 ^[6]

識別できる胞子の種類には、自由胞子、中央胞子（細胞の中央）、亜末端胞子（細胞の端と中央の間）、末端（細胞の端）胞子があります。また、末端胞子と亜末端胞子の組み合わせもあります。胞子は、球形または楕円形（楕円形）の形状、細胞に対するサイズ、細胞が膨らんでいるように見えるかどうかに基づいて区別できます。^[2]

シェーファー・フルトン染色法では、細菌を蒸気で加熱することで、マラカイトグリーンを含む一次染色液を胞子に浸透させます。マラカイトグリーンは、胞子を染色するためにスライド上に15分以上放置することができます。胞子は密度が高いため染色に時間がかかるため、この分別染色を行う際には熱が媒染剤として作用します。マラカイトグリーンは水溶性であるため、栄養細胞と胞子母細胞は蒸留水で脱色し、0.5%サフラニンで対比染色することができます。^[7]最終的に、適切な塗抹標本では、赤色またはピンク色の細胞内の緑色の点として胞子が示されます。^[2]

マイコバクテリアは、このタイプの染色プロセスで直面する障害の 1 つです。マイコバクテリアは、胞子を生成しないにもかかわらず、緑色に染まってしまうからです。これは、脱色プロセス後もマラカイト グリーンの染料を保持するワックス状の細胞壁のためです。この特定のタイプの細菌についてさらに情報を得るには、抗酸染色と呼ばれる別のタイプの染色を行う必要があります。

出典: ^[2]

1. 無菌技術を使用して、目的の生物を熱固定したスライドを準備し、空気乾燥させます。
2. 沸騰したお湯を用意します。
3. スライドをペーパータオルで覆い、ウォーターバス上の染色ラックに置きます。
4. スライド上のペーパータオルにマラカイトグリーン（一次染色）をたっぷり塗ります。
5. スライドを5〜7分間蒸します（媒染）。
6. 時間が経過したら、ピンセットを使用してスライドを慎重にウォーターバスから取り出します。ペーパータオルを取り外します。
7. スライドを冷ましてから、染色ラックの上でピンセットを使用して、流出液が透明になるまで蒸留水で静かにすすいでください（脱色剤）。
8. 余分な水を捨て、スライドを染色ラックに置き、サフラニン（対比染色）で 1 分間浸します。
9. 余分なサフラニンを蒸留水で優しく洗い流し、両面を丁寧に拭いて乾かします。
10. スライドが乾いたら、油浸対物レンズ（100 倍）を使用して顕微鏡でスライドを観察します。