固定（組織学）

組織学、病理学、細胞生物学の分野において、固定とは、自己分解や腐敗による腐敗から生物組織を保護することである。これにより、進行中の生化学反応が停止し、処理された組織の機械的強度や安定性も向上する。組織固定は、組織切片を作製する上で重要なステップであり、その主な目的は、細胞と組織成分を保存し、薄い染色切片を作製できるようにすることにある。これにより、タンパク質や核酸などの高分子（細胞内および細胞周囲）の形状とサイズによって決まる組織の構造を調査することができる。

固定剤は保護的な役割を果たすにあたり、凝固、添加剤の形成、または凝固と添加剤のプロセスの組み合わせによってタンパク質を変性させます。高分子に化学的に付加する化合物は、2 つの異なる高分子の一部と結合できる場合、架橋と呼ばれる効果によって最も効果的に構造を安定化します。組織の固定はいくつかの理由で行われます。理由の 1 つは、死後の腐敗 (自己分解と腐敗) を防ぐために組織を殺すことです。^[1] 固定により、検査用に組織を準備する過程で、生物学的材料 (組織または細胞) を可能な限り自然の状態に近い状態で保存します。これを達成するには、通常、いくつかの条件を満たす必要があります。

まず、固定液は通常、サンプルを分解したり損傷したりする 固有の生体分子、特にタンパク質分解 酵素を無効にする働きをします。

第二に、固定液は通常、サンプルを外的損傷から保護します。固定液は、組織サンプル内に存在するか、固定された組織に定着する可能性のあるほとんどの一般的な微生物 (特に細菌) に対して有毒です。さらに、多くの固定液は、固定された材料を化学的に変化させて、日和見微生物にとって口当たりの悪いもの (消化できないか毒性がある) にします。

最後に、固定液は細胞や組織を分子レベルで変化させて、機械的強度や安定性を高めることがよくあります。この強度と剛性の向上により、サンプルをさらに分析するために処理する際に、サンプルの 形態(形状と構造) を保存することができます。

最も注意深い固定でさえも、サンプルを変化させ、細胞の超微細構造の解釈を妨げるアーティファクトを導入することがあります。顕著な例は細菌のメソソームで、 1970年代にはグラム陽性細菌の細胞小器官であると考えられていましたが、後に電子顕微鏡用に開発された新しい技術によって、化学固定によるアーティファクトに過ぎないことが示されました。^{[2] [3]}固定やその他の組織処理手順の標準化では、どの手順でどのような種類のアーティファクトが導入されるかを確立することにより、このアーティファクトの導入を考慮に入れています。各組織タイプと処理技術でどのような種類のアーティファクトが予想されるかを知っている研究者は、アーティファクトのある切片を正確に解釈したり、関心領域のアーティファクトを最小限に抑える技術を選択したりできます。

固定は通常、顕微鏡検査やその他の分析用に生物材料のサンプルを準備する多段階のプロセスの最初の段階です。したがって、固定剤と固定プロトコルの選択は、計画されている追加の処理手順と最終分析によって異なります。たとえば、免疫組織化学では、特定のタンパク質ターゲットに結合する抗体を使用します。固定が長引くと、これらのターゲットが化学的に隠され、抗体の結合が妨げられる可能性があります。このような場合、通常は、約 24 時間冷ホルマリンを使用する「クイック フィックス」法が使用されます。クイック フィックスにはメタノール (100%) も使用できますが、その時間は生物材料によって異なります。たとえば、MDA-MB 231ヒト乳がん細胞は、冷メタノール (-20 °C) で 3 分間しか固定できません。酵素の局在性研究の場合、組織は軽く事前固定するか、酵素活性産物が形成された後に事後固定する必要があります。

固定する必要があるサンプルに応じて、一般的に 3 種類の固定プロセスがあります。

熱固定は、単細胞生物、最も一般的には細菌や古細菌の固定に使用されます。生物は通常、サンプルを均一に広げるのに役立つ水または生理食塩水と混合されます。希釈されたサンプルは、顕微鏡スライド上に広げられます。この希釈された細菌サンプルは、スライドに置かれた後、一般的に塗抹標本と呼ばれます。塗抹標本が室温で乾燥した後、スライドはトングまたは洗濯ばさみでつかまれ、ブンゼンバーナーの炎に数回通され、生物が熱で殺されてスライドに付着します。マイクロ焼却装置も使用できます。加熱後、サンプルは通常染色され、顕微鏡を使用して画像化されます。^[4]熱固定では、一般的に全体的な形態は保存されますが、内部構造は保存されません。熱はタンパク質分解酵素を変性させ、自己分解を防ぎます。熱固定は莢膜染色法では使用できません。熱固定により莢膜 (グリコカリックス) が収縮または破壊され、染色では確認できないためです。^[5]

浸漬法は、単一細胞から生物全体まで、組織学的サンプルを固定するために使用できます。組織サンプルは、一定時間固定液に浸されます。固定液の容量は、組織の容量の少なくとも10倍である必要があります。^[6]固定を成功させるには、固定液が組織全体に拡散する必要があるため、組織のサイズと密度、および固定液の種類を考慮する必要があります。これは細胞アプリケーションでは一般的な手法ですが、より大きな組織にも使用できます。大きなサンプルを使用する場合は、固定液が深部組織に到達するために、より長い時間浸漬する必要があります。^[7]

灌流とは、血管や臓器や生物の自然な経路を通る液体の通過である。灌流による組織固定では、通常は左心室に挿入された針を介して固定剤が循環系に送り込まれる。これは超音波ガイドを介して、または対象の胸腔を開くことによって行うことができる。^[8]固定剤は、典型的な心拍出量に一致する注入量で心臓に注入される。生来の循環系を使用して、固定剤は全身に行き渡るため、組織は固定されるまで死なない。この方法を使用する場合は、固定剤と緩衝剤の量を追加するために、循環系のどこかに排出ポートを追加する必要があり、これは通常右心房で行われる。固定剤は、すべての血液が置き換わるまで循環系に送り込まれる。灌流法には形態を保存できるという利点があるが^[9]、欠点は対象が死ぬことと、大型生物には必要な固定液の量が多く、コストが上昇する可能性があることである。研究対象ではない組織に栄養を送る動脈を挟むことで、灌流固定に必要な液体の量を減らすことが可能である。灌流固定は、げっ歯類の脳、肺、腎臓組織の画像化によく使用され、人間の剖検にも使用される。^{[7] [10]}

浸漬固定法と灌流固定法の両方において、化学固定剤を使用して、構造を可能な限り生体組織に近い状態（化学的にも構造的にも）で保存します。これには化学固定剤が必要です。

架橋固定剤は、組織内のタンパク質間に共有化学結合を形成することによって作用する。これにより可溶性タンパク質が細胞骨格に固定され、組織にさらなる剛性が付与される。胚分化波中の収縮などの一時的または微細な細胞骨格構造の保存は、架橋固定剤を添加する前にマイクロ波を用いた前処理によって最もよく達成される。^{[11] [12]}

組織学で最も一般的に使用される固定剤はホルムアルデヒドです。これは通常、10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) として使用され、これは pH 7 のリン酸緩衝液中に約 3.7%～4.0% のホルムアルデヒドが含まれています。ホルムアルデヒドは室温では気体であるため、ホルムアルデヒド固定剤を作る際には、水に溶解したホルムアルデヒドガス (約 37% w/v) であるホルマリンが使用されます。ホルムアルデヒドは、主に塩基性アミノ酸リジンの残基であるタンパク質を架橋結合させることで組織を固定します。その効果は過剰な水によって可逆的であり、ホルマリンによる色素沈着を防ぎます。パラホルムアルデヒドもよく使用され、加熱すると解重合してホルマリンに戻るため、これも効果的な固定剤となります。パラホルムアルデヒドの他の利点としては、長期保存や組織への浸透性が優れていることが挙げられます。特に免疫組織化学技術に適しています。ホルムアルデヒド蒸気は、細胞塗抹標本の固定剤としても使用できます。

固定によく使われるもう 1 つのアルデヒドはグルタルアルデヒドです。これはホルムアルデヒドと同様に作用し、タンパク質の α ヘリックスを変形させます。しかし、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドよりも分子が大きいため、膜への浸透が遅くなります。その結果、厚い組織サンプルへのグルタルアルデヒド固定は困難になる可能性がありますが、組織サンプルのサイズを小さくすることで問題を解決できます。グルタルアルデヒド固定の利点の 1 つは、より硬い、またはしっかりと結合した固定製品を提供できることです。長さが長く、2 つのアルデヒド基があるため、より離れたタンパク質分子のペアを「橋渡し」して結合できます。これは急速で不可逆的な変化を引き起こし、電子顕微鏡検査に適しており、4 °C でうまく機能し、細胞質と核の全体的な詳細を最もよく示します。ただし、免疫組織化学染色には理想的ではありません。

一部の固定プロトコルでは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを組み合わせて、それぞれの強みを補完することが求められます。

これらの架橋固定剤、特にホルムアルデヒドは、タンパク質の二次構造を保存する傾向があり、ほとんどの三次構造も保存する可能性があります。

沈殿（または変性）固定剤は、タンパク質分子の溶解度を低下させ、多くのタンパク質に三次構造を与える疎水性相互作用を破壊することによって作用します。タンパク質の沈殿と凝集は、アルデヒド固定剤で発生する架橋とはまったく異なるプロセスです。

最も一般的な沈殿固定液はエタノールとメタノールです。これらは凍結切片や塗抹標本の固定によく使用されます。アセトンも使用され、アセトンメチルベンゾエートキシレン (AMEX) 法で使用した場合、凍結切片よりも優れた組織学的保存効果が得られることがわかっています。

タンパク質変性メタノール、エタノール、アセトンは、核酸の研究でない限り、ブロックの固定に単独で使用されることはほとんどありません。

酢酸は変性剤であり、デイビッドソンのAFAなどの他の沈殿固定剤と組み合わせて使用​​されることがあります。^{[13]アルコール自体は固定中に組織のかなりの収縮と硬化を引き起こすことが知られていますが、酢酸のみでは組織の膨張が伴います。この2つを組み合わせると、組織}形態のより良い保存が得られる可能性があります。

酸化固定剤は、タンパク質やその他の生体分子の側鎖と反応して、組織構造を安定化する架橋を形成できます。ただし、微細な細胞構造は維持されるものの、大幅な変性を引き起こすため、主に二次固定剤として使用されます。

四酸化オスミウムは、電子顕微鏡検査用にサンプルを準備する際の二次固定剤としてよく使用されます。(組織の厚い部分にはほとんど浸透しないため、光学顕微鏡検査には使用されません。)

二クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウムはいずれも、特定の組織学的標本に使用されます。

B-5 やZenker 固定液などの水銀剤には、染色の明るさを増し、核の細部まで鮮明に表示するという未知のメカニズムがあります。水銀剤は浸透が速いにもかかわらず、浸透性が低く、組織を収縮させます。最適な用途は、造血組織と網状内皮組織の固定です。また、水銀が含まれているため、廃棄には注意が必要です。

ピクリン酸塩は組織によく浸透し、ヒストンや塩基性タンパク質と反応してアミノ酸と結晶性ピクリン酸塩を形成し、すべてのタンパク質を沈殿させます。結合組織の固定剤として適しており、グリコーゲンをよく保存し、脂質を抽出して、生体ホルモンやポリペプチドホルモンの免疫染色においてホルムアルデヒドよりも優れた結果をもたらします。ただし、固定後に標本を徹底的に洗浄しないと、好塩基球が失われます。

ヘペス-グルタミン酸緩衝液媒介有機溶媒保護効果 (HOPE) により、ホルマリンのような形態が得られ、免疫組織化学および酵素組織化学におけるタンパク質抗原の優れた保存性、良好な RNA および DNA 収量、および架橋タンパク質が存在しないという利点があります。

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