ミクロトーム

精密切断腎臓切片とは、腎臓の機能、薬物代謝、または疾患プロセスを研究するためにミクロトームを使用して作成された腎臓組織の薄い切片を指します。研究者はこれらの切片を使用して、物質が腎機能に及ぼす影響を研究します。^{[ 15 ] [ 16 ]}これには、薬物代謝^{[ 17 ] [ 18 ]}および毒性物質の影響^{[ 19 ]が含まれます。}

スレッド式ミクロトームは、試料を固定ホルダー（シャトル）にセットし、それがナイフの上を前後に移動する装置です。現代のスレッド式ミクロトームは、スレッドがリニアベアリング上に設置されており、この設計により、ミクロトームは多くの粗い切片を容易に切断できます。^{[ 20 ]}試料とミクロトームナイフの間の角度を調整することで、切断中に試料にかかる圧力を軽減できます。^{[ 20 ]}この設計のミクロトームの典型的な用途は、生物学的標本用にパラフィンに包埋された試料など、大きな試料の調製です。スレッド式ミクロトームで達成可能な典型的な切断厚さは、1～60μmです 。

この装置は一般的なミクロトームの設計です。この装置は段階的な回転動作で動作し、実際の切断は回転運動の一部となっています。回転式ミクロトームでは、ナイフは通常垂直位置に固定されており、^{[ 21 ]}組織ブロックがブレードに向かって上下に移動し、ブロックを薄い切片に切断します。

左の図では、切断の原理が説明されています。試料ホルダーの動きによって、試料はナイフによって位置1から位置2まで切断され、この時点で新しい切片がナイフ上に残ります。回転運動の最高点で、試料ホルダーは切断する切片と同じ厚さだけ前進し、次の切片の切断が可能になります。

多くのミクロトームでは、フライホイールを手動で操作できます。フライホイールの質量が比較的大きいため、試料の切断中に試料が停止することがなく、きれいに切断できるという利点があります。最新機種では、フライホイールはミクロトームの筐体内部に組み込まれていることがよくあります。回転式ミクロトームの一般的な切断厚さは1～60μmです 。合成樹脂に包埋された試料のような硬い材料の場合、この設計のミクロトームでは、厚さ0.5μmという薄さの良好な「半薄」切片を作製できます 。

凍結サンプルの切断には、多くの回転式ミクロトームを液体窒素チャンバー内で切断できるように改造することができ、いわゆるクライオミクロトーム装置が用いられる。温度を下げることで、ガラス転移を起こすなどしてサンプルの硬度を高めることができ、半薄サンプルの作製が可能になる。^{[ 20 ]}ただし、得られるサンプルの厚さを最適化するためには、サンプルの温度とナイフの温度を制御する必要がある。

超ミクロトームは超ミクロトーム法の主要なツールです。回転式ミクロトームと同様の仕組みで極めて薄い切片を作製できますが、機械構造の公差が非常に厳密です。精密な機械構造により、マウントの線膨張を利用して厚さを非常に細かく制御できます。^{[ 20 ]}

これらの極薄切片は、透過型電子顕微鏡(TEM) および連続ブロックフェース走査型電子顕微鏡(SBFSEM) で使用するために重要であり、場合によっては光学顕微鏡でも重要です。^{[ 21 ]}これらの切片の典型的な厚さは、透過型電子顕微鏡では 40 ～ 100 nm、 SBFSEM では 30 ～ 50 nm です。厚さ 500 nm までのより厚い切片も、特殊な TEM アプリケーションや、最終的な薄切片の領域を選択するための光学顕微鏡の調査切片用に採取されます。超ミクロトームでは、ダイヤモンドナイフ(好ましくは) とガラスナイフが使用されます。切片を収集するには、切断時に液体の上に浮かべ、TEM 試料観察に適したグリッドに慎重に拾い上げます。切片の厚さは、極めて薄い試料の厚さの結果として見られる反射光の薄膜干渉色によって推定できます。 ^{[ 22 ]}  

振動式ミクロトームは、振動する刃を使用して切断を行うため、固定刃の場合よりも少ない圧力で切断できます。振動式ミクロトームは通常、切断が難しい生物学的サンプルに使用されます。^{[ 20 ]}切断厚さは、 生体組織の場合は通常30～500μm、 固定組織の場合は10～500μmです。^{[ 23 ]}

鋸式ミクロトームは、歯や骨などの硬い材料に特に適しています。このタイプのミクロトームは、試料をスライスする回転鋸が埋め込まれています。最小切断厚さは約30μmで 、比較的大きな試料にも対応できます。^{[ 20 ]}

レーザーミクロトームは、非接触スライス用の装置です。^{[ 24 ]}包埋、凍結、化学固定による試料の事前準備は不要で、準備方法によるアーティファクトを最小限に抑えることができます。また、この設計のミクロトームは、骨や歯などの非常に硬い材料や、一部のセラミックにも使用できます。試料材料の特性に応じて、10～100μmの厚さを実現できます 。

この装置は、赤外線レーザーの切断作用を利用して動作します。レーザーは近赤外線領域の光を放射するため、この波長域では生体材料と相互作用することができます。試料内でプローブを精密に集束させることで、最大TW /cm²^という非常に高い強度を持つ焦点が得られます。焦点領域における光の浸透の非線形相互作用により、光破壊と呼ばれるプロセスで材料の分離が起こります。レーザーパルスの持続時間をフェムト秒の範囲に制限することで、ターゲット領域で消費されるエネルギーが精密に制御され、切断の相互作用領域が1マイクロメートル未満に制限されます。この領域の外側では、超短ビーム照射時間により、試料の残りの部分に熱損傷がほとんど、あるいは全く生じません。

レーザー光は、高速走査ミラーを用いた光学系に照射され、ビームの交差位置を三次元的に制御するとともに、ビームを目的の領域まで走査することが可能です。高出力と高速走査を組み合わせることで、短時間で広範囲の試料を切断できます。レーザーミクロトームでは、組織内部、細胞構造、その他の微細構造のレーザーマイクロダイセクションも可能です。

一般的に、ナイフは刃の形状によって特徴づけられ、それは平面凹型、楔形、または鑿形といったデザインに分類される。

平面凹型ミクロトームナイフは非常に鋭利ですが、非常に繊細なため、非常に柔らかいサンプルにのみ使用されます。^{[ 21 ]}ウェッジプロファイルナイフはやや安定性が高く、エポキシ樹脂や極低温サンプルの切断など、中程度の硬さの材料に使用されます。最後に、鈍いエッジを持つノミ型プロファイルはナイフの安定性を高めますが、切断するにはかなり大きな力が必要になります。

超ミクロトームにはガラスナイフとダイヤモンドナイフが必要です。そのため、刃の切断幅は数ミリメートル程度で、従来のミクロトームナイフよりもかなり小さくなります。ガラスナイフは通常、特殊な「ナイフメーカー」破砕装置を使用してガラス棒を破砕することによって製造されます。最終的な切片作成にダイヤモンドナイフを使用する場合でも、初期のサンプル準備にはガラスナイフを使用できます。ガラスナイフには通常、プラスチックテープで作られた小さな溝があり、そこに水を入れてサンプルを浮かせて後で回収できるようにします。^{[ 20 ]}ダイヤモンドブレードは、このような既存の溝に組み込むことができ、同じ回収方法が可能になります。

マイクロトームで切断する前に、生物試料は通常、より硬い固定液に包埋されます。この工程は包埋と呼ばれます。包埋は、パラフィン（ワックス）やエポキシなどの液体物質を試料の周囲に流し込み、型に入れて硬化させることで、容易に切断できる「ブロック」を作製することによって行われます。

傾斜角とは、試料の垂直方向とナイフの刃との接触角度のことです。ナイフの刃が直角（傾斜角＝90度）の場合、圧力を利用した直接切断が行われ、そのため力が比例して大きくなります。一方、ナイフを傾けると、ナイフの相対的な動きが試料の動きと平行になり、スライス動作が可能になります。この挙動は、大型試料や硬い試料の場合に非常に重要です。

ナイフの傾斜角とは、ナイフの刃先と試料との間の角度のことです。最適な結果を得るためには、この角度を適切に選択する必要があります。最適な角度は、ナイフの形状、切断速度、その他多くのパラメータによって異なります。角度をゼロに設定すると、ナイフの切断が不規則になることが多く、これを解消するためにナイフの位置を調整する必要があります。

角度が大きすぎると、試料が折れ曲がったり、切断面に周期的な厚みのばらつきが生じたりする可能性がある。さらに角度を大きくしすぎると、刃自体を損傷する恐れがある。