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ゲノム編集、ゲノム工学、または遺伝子編集とは、生物のゲノムにDNAを挿入、削除、改変、または置換する遺伝子工学の一種である。宿主ゲノムに遺伝物質をランダムに挿入する初期の遺伝子工学技術とは異なり、ゲノム編集では挿入部位を特定の場所に絞り込むことができる。
制限エンドヌクレアーゼと呼ばれるプログラム可能な分子（遺伝子エディターまたは分子ハサミとも呼ばれる）は、ゲノム内の目的の場所に二本鎖切断（DSB）を作成するために使用されます。誘導された切断は、相同組換え（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、標的となる変異が生じます。[ 1 ] [ 2 ]
2015年のCRISPR遺伝子編集技術の開発により、大規模ゲノム編集の効率性、特異性、実用性が向上した。[ 3 ]
ゲノム編集の最も初期かつ最も効率的な方法の 1 つは、塩基編集です。[ 4 ] [ 5 ]ゲノム DNA 鎖の切断と再結合を必要としないため、これらの手順に伴うランダムな挿入と欠失を回避できます。ただし、単一のヌクレオチドの正確な編集にのみ適しています。核酸ガイド配列によって指示される核酸塩基修飾酵素を使用します。1990 年代に初めて記述され、最近再び注目を集めています。[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 4 ]
2015年以来、ゲノム編集は生存不可能なヒト胚で実験的に研究されてきた。[ 9 ] 2019年には、物議を醸した賀建奎事件の結果として、CRISPR技術を用いたゲノム編集胚から最初のヒトが誕生した。[ 10 ]
ゲノム編集は1990年代に開拓されましたが[ 6 ] 、現在一般的に使われているヌクレアーゼベースの遺伝子編集プラットフォームが登場する以前のことです。しかし、編集効率が低いため、その利用は制限されていました。
2000年代には、人工ヌクレアーゼ（「分子ハサミ」とも呼ばれる）を用いたゲノム編集が導入された。2011年現在3種類の人工ヌクレアーゼファミリー、すなわちメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（TALEN）が使用された。これらはすべて、Nature Methods誌によって2011年の年間最優秀手法に選ばれた。[ 11 ] 2015年にはCRISPR-Casシステムが導入され、[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] Science誌によって2015年の年間最優秀ブレークスルーに選ばれた。 [ 16 ] 2017年時点で 9種類のゲノムエディターが利用可能であった。[ 17 ]
2018年当時、このようなゲノム編集の一般的な手法は、人工ヌクレアーゼを用いてゲノム内の目的の場所に二本鎖切断（DSB）を誘導するものでした。誘導された二本鎖切断は、非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HR）によって修復され、標的部位に突然変異（「編集」）が生じます。
2019年5月、中国の弁護士らは、中国の科学者である賀建奎氏が世界初の遺伝子編集された人間を作成したとされること（ルルとナナの論争を参照）を受けて、 CRISPRなどの遺伝子編集技術によってヒトゲノムを操作する者は、関連するあらゆる悪影響に対して責任を負うという規制案が策定されていると報告した。 [ 10 ] CRISPRおよび関連するバイオテクノロジーの潜在的な盲点とリスクに関する注意深い見解が最近議論されており、[ 18 ]細胞制御プロセスの確率的性質に焦点が当てられている。
エジンバラ大学 ロスリン研究所は、豚繁殖呼吸器症候群を引き起こすウイルスに耐性のある豚を遺伝子操作した。このウイルスは、米国と欧州の養豚農家に年間26億ドルの損失をもたらしている。[ 19 ]
2020年2月、米国で行われた臨床試験で、3人の癌患者に対するCRISPR遺伝子編集が安全に実施されたことが示された。[ 20 ] 2020年には、リラックス効果を促進するとされるアミノ酸を多く含むトマトであるシチリアンルージュハイGABAが日本で販売承認された。[ 19 ]
2021年、イングランド（英国の他の地域ではない）は、遺伝子編集された植物や動物に対する規制を撤廃し、欧州連合に準拠した規制から米国や他のいくつかの国の規制に近い規則に移行する計画を立てた。2021年4月の欧州委員会の報告書は、現在の規制体制が遺伝子編集に適していないという「強い兆候」を発見した。[ 19 ] 2021年後半、研究者らは、トランスポゾンに見られるエンドヌクレアーゼとしてIscB、IsrB、TnpBを含む必須可動要素誘導活性（OMEGA）タンパク質と名付けられたCRISPRの代替法を発表し、小さなωRNAによって誘導される。[ 21 ] [ 22 ]
2026年、上海交通大学医学部の邱子龍氏とそのチームは、マウスとサルで塩基編集を用いてスナイダーズ・ブロック・カンポー症候群の原因となるCHD3遺伝子を修正することに成功したと発表した。[ 23 ]その後、邱氏が1年前に上海の新華病院で6歳の少女を治療し、修正遺伝子を髄液に運ぶために遺伝子操作されたウイルスを使用していたことが判明した。少女は数日後に血栓性微小血管症で死亡した。 [ 24 ]
遺伝子工学は、生物に新しい遺伝要素を導入する方法として、1970年代から存在しています。この技術の欠点の1つは、DNAが宿主のゲノムにランダムに挿入されるため、生物内の他の遺伝子を損なったり変化させたりする可能性があることです。しかし、挿入された遺伝子を生物のゲノム内の特定の部位に標的とするいくつかの方法が発見されています。[ 6 ]また、ゲノム内の特定の配列の編集や、オフターゲット効果の低減も可能になりました。これは、特定の遺伝子に突然変異を標的とする研究目的や、遺伝子治療に使用できます。機能的な遺伝子を生物に挿入し、欠陥のある遺伝子と置き換えるように標的とすることで、特定の遺伝性疾患を治療できる可能性があります。
生物のゲノム内の特定の部位に遺伝子を標的とする初期の方法（遺伝子ターゲティングと呼ばれる）は、相同組換え（HR）に依存していた。[ 25 ]標的ゲノム配列に一致するテンプレートを含むDNA構築物を作成することにより、細胞内のHRプロセスによって構築物が目的の場所に挿入される可能性がある。この方法を胚性幹細胞に適用することで、標的遺伝子がノックアウトされたトランスジェニックマウスが開発された。遺伝子をノックインしたり、遺伝子発現パターンを変更したりすることも可能になった。[ 26 ]相同組換えを使用して胚性幹細胞を介してマウスに遺伝子改変を導入する方法を発見した功績により、マリオ・カペッキ、マーティン・エバンス、オリバー・スミシーズは2007年のノーベル生理学・医学賞を受賞した。[ 27 ]
重要な遺伝子がノックアウトされると、生物にとって致命的となる可能性がある。これらの遺伝子の機能を研究するために、部位特異的組換え酵素（SSR）が使用された。最も一般的な2つのタイプは、Cre-LoxPシステムとFlp-FRTシステムである。Cre組換え酵素は、Lox-P部位として知られる結合配列間の相同組換えによってDNAを除去する酵素である。Flip-FRTシステムも同様の方法で機能し、Flip組換え酵素はFRT配列を認識する。目的の遺伝子を挟む組換え酵素部位を持つ生物と、組織特異的プロモーターの制御下でSSRを発現する生物を交配することで、特定の細胞でのみ遺伝子をノックアウトまたはオンにすることが可能である。これらの技術は、トランスジェニック動物からマーカー遺伝子を除去するためにも使用された。これらのシステムのさらなる改良により、研究者は特定の条件下でのみ組換えを誘導できるようになり、遺伝子を目的の時期または発生段階でノックアウトまたは発現させることが可能になった。[ 26 ]
一般的なゲノム編集法は、DNA二本鎖切断（DSB）修復メカニズムの概念に基づいています。DSBを修復する主な経路は、非相同末端結合（NHEJ）と相同性指向修復（HDR）の2つです。NHEJはさまざまな酵素を使用してDNA末端を直接結合しますが、より正確なHDRは相同配列をテンプレートとして使用して、切断点の欠落したDNA配列を再生します。これは、 DSBの隣接配列と相同な配列内に目的の遺伝要素を含むベクターを作成することで利用できます。これにより、DSBの部位に目的の変化が挿入されます。HDRベースの遺伝子編集は相同組換えベースの遺伝子ターゲティングと似ていますが、組換えの速度は少なくとも3桁増加します。[ 28 ]
ゲノム編集の鍵は、ゲノム内の特定の位置に二本鎖切断（DSB）を作り出すことです。一般的に使用される制限酵素はDNAを切断するのに効果的ですが、通常は複数の部位を認識して切断します。この課題を克服し、部位特異的なDSBを作り出すために、現在までに4つの異なるクラスのヌクレアーゼが発見され、バイオエンジニアリングされています。
1980年代後半に発見されたメガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼファミリーに属する酵素で、大きなDNA配列（14～40塩基対）を認識して切断する能力を特徴としています。[ 29 ]最も広く普及し、最もよく知られているメガヌクレアーゼは、保存されたアミノ酸配列にちなんで名付けられたLAGLIDADGファミリーのタンパク質です。
微生物種によく見られるメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列（>14bp）を持つという独特の性質を持ち、そのため非常に特異性が高い。[ 30 ] [ 31 ]しかし、特定のDNA配列に作用するために必要な正確なメガヌクレアーゼを見つけることは事実上不可能である。この課題を克服するために、変異誘発とハイスループットスクリーニング法が、独自の配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体の作成に使用されてきた。[ 31 ] [ 32 ]また、さまざまなメガヌクレアーゼを融合させて、新しい配列を認識するハイブリッド酵素を作成することに成功した者もいる。[ 33 ] [ 34 ]さらに、合理的に設計されたメガヌクレアーゼと呼ばれる方法で、メガヌクレアーゼのDNA相互作用アミノ酸を変更して、配列特異的なメガヌクレアーゼを設計しようとした者もいる。[ 35 ]別のアプローチとしては、コンピューターモデルを使用して、改変されたメガヌクレアーゼの活性と認識される核酸配列の特異性をできるだけ正確に予測しようとするものがある。[ 36 ]
数万個のタンパク質ユニットを含む大規模なバンクが構築された。これらのユニットを組み合わせることで、標的部位を認識するキメラ型メガヌクレアーゼが得られ、基礎研究、医療、農業、産業、エネルギーなど幅広いニーズを満たす研究開発ツールが提供される。これには、ヒトXPC遺伝子を切断できる2つのメガヌクレアーゼの工業規模生産が含まれる。この遺伝子の変異は色素性乾皮症を引き起こし、患者は皮膚がんになりやすく、皮膚が紫外線にさらされると火傷を起こす重篤な単一遺伝子疾患である。 [ 37 ]
メガヌクレアーゼは、より厳密なDNA配列認識のためか、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）などの方法よりも細胞への毒性が低いという利点があります。 [ 31 ]しかし、すべての可能な配列に対して配列特異的な酵素を構築するにはコストと時間がかかり、ZFNやTALENベースの融合などの方法が利用する組み合わせの可能性から利益を得ることができません。
メガヌクレアーゼとは対照的に、ZFNとTALEN技術の背後にある概念は、非特異的なDNA切断触媒ドメインに基づいており、これを亜鉛フィンガーや転写活性化因子様エフェクター（TALE）などの特定のDNA配列認識ペプチドに連結することができる。[ 38 ]この最初のステップは、DNA認識部位と切断部位が互いに分離しているエンドヌクレアーゼを見つけることであった。これは制限酵素の中で最も一般的な状況ではない。[ 38 ]この酵素が見つかると、認識能力がないため非常に非特異的な切断部分を分離することができる。この部分を配列認識ペプチドに連結することで、非常に高い特異性を得ることができる。
亜鉛フィンガーモチーフは、いくつかの転写因子に見られる。ヒトタンパク質の8%に含まれる亜鉛イオンは、タンパク質の三次元構造の形成において重要な役割を果たしている。転写因子においては、亜鉛イオンはタンパク質とDNAの相互作用部位に最も多く存在し、モチーフを安定化させる。各フィンガーのC末端部分は、DNA配列の特異的な認識を担っている。
認識される配列は短く、約3塩基対から構成されているが、認識部位が特徴づけられた6～8個のジンクフィンガーを組み合わせることで、約20塩基対の配列に対する特異的なタンパク質を得ることが可能である。したがって、特定の遺伝子の発現を制御することが可能である。この戦略は、動物における血管新生のプロセスを促進するために使用できることが実証されている。 [ 39 ]また、このように構築されたタンパク質をエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させて標的DNA切断を誘導し、これらのタンパク質をゲノム編集ツールとして使用することも可能である。[ 40 ]
このために一般的に採用されている方法は、それぞれ3～6個の特定の亜鉛フィンガーを含む2つのDNA結合タンパク質を、二本鎖DNAを切断するために二量体化する必要のあるFokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに結合させることです。2つのタンパク質は、数ヌクレオチド離れた2つのDNA配列を認識します。2つの亜鉛フィンガータンパク質をそれぞれの配列に連結すると、2つのFokIドメインがより近くなります。FokIはヌクレアーゼ活性を持つために二量体化を必要とし、これは各ヌクレアーゼパートナーが固有のDNA配列を認識するため、特異性が劇的に向上することを意味します。この効果を高めるために、ヘテロ二量体としてのみ機能するFokIヌクレアーゼが設計されています。 [ 41 ]
選択された配列に対して特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼを設計するために、いくつかの手法が用いられています。最も広く用いられているのは、既知の特異性を持つジンクフィンガーユニットを組み合わせる（モジュールアセンブリ）方法です。細菌、酵母、または哺乳類細胞を用いたさまざまな選択技術が開発され、最高の特異性と最高の細胞耐性を提供する組み合わせが特定されています。ジンクフィンガーヌクレアーゼ活性のゲノム全体にわたる直接的な特性評価は報告されていませんが、細胞内の二本鎖DNA切断の総数を測定するアッセイでは、24 bpの複合認識部位と必須ヘテロ二量体FokIヌクレアーゼドメインを持つジンクフィンガーヌクレアーゼで処理した細胞では、バックグラウンドを超える切断は1～2個しか発生しないことがわかりました。[ 41 ]
ヘテロ二量体機能ヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性の可能性を回避し、DSBの特異性を高める。ZFNとTALEN構築物のヌクレアーゼ部分は類似した特性を持つが、これらの人工ヌクレアーゼの違いはDNA認識ペプチドにある。ZFNはCys2-His2ジンクフィンガーに依存し、TALEN構築物はTALEに依存する。これらのDNA認識ペプチドドメインはどちらも、タンパク質中に自然に組み合わせて存在するという特徴を持つ。Cys2-His2ジンクフィンガーは通常3 bp間隔で繰り返され、転写因子などのさまざまな核酸相互作用タンパク質に多様な組み合わせで存在する。ジンクフィンガードメインの各フィンガーは完全に独立しており、1つのフィンガーの結合能力は隣接するフィンガーによって影響を受ける。一方、TALEは、アミノ酸と認識されるヌクレオチド対の認識比が1対1の繰り返しで存在する。亜鉛フィンガーとTALEはどちらも繰り返しパターンで出現するため、さまざまな組み合わせを試して、幅広い配列特異性を作り出すことができます。[ 30 ]亜鉛フィンガーはこれらの用語でより確立されており、モジュールアセンブリ（トリプレット配列と相関する亜鉛フィンガーを必要な配列をカバーするように一列に取り付ける）、OPEN（トリプレットヌクレオチドに対するペプチドドメインの低ストリンジェンシー選択に続いて、細菌システムでの最終ターゲットに対するペプチド組み合わせの高ストリンジェンシー選択）、亜鉛フィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングなどのアプローチが、部位特異的ヌクレアーゼを作成するために使用されています。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、特にジンクフィンガーコンソーシアムの研究室によって、さまざまなゲノムの改変にすでに使用されている研究開発ツールです。米国の企業Sangamo BioSciencesは、幹細胞の遺伝子工学と治療目的の免疫細胞の改変に関する研究を行うためにジンクフィンガーヌクレアーゼを使用しています。 [ 42 ] [ 43 ]改変されたTリンパ球は現在、ある種の脳腫瘍（膠芽腫）の治療とエイズとの闘いにおいて第I相臨床試験を受けています。[ 41 ]
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、33または34アミノ酸の繰り返し配列を特徴とする特異的なDNA結合タンパク質です。TALENは、ヌクレアーゼのDNA切断ドメインをTALEドメインに融合させて設計された人工制限酵素であり、特定のDNA配列を特異的に認識するように調整できます。これらの融合タンパク質は、生細胞内で配列の挿入、削除、修復、置換などの標的ゲノム改変を実行できる遺伝子編集アプリケーションにおいて、容易に標的化できる「DNAはさみ」として機能します。[ 44 ]任意の目的のDNA配列に結合するように設計できるDNA結合ドメインは、植物病原菌Xanthomanos appによって分泌されるDNA結合タンパク質であるTALエフェクターに由来します。TALエフェクターは、それぞれが高度に保存された34アミノ酸配列を含む繰り返しドメインで構成され、標的部位内の単一のDNAヌクレオチドを認識します。このヌクレアーゼは標的部位で二本鎖切断を引き起こすことができ、これはエラーを起こしやすい非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、小さな挿入または欠失の導入によって遺伝子破壊を引き起こします。各リピートは保存されていますが、アミノ酸位置12と13にあるいわゆるリピート可変ジ残基（RVD）は例外です。RVDはTALEが結合するDNA配列を決定します。TALEリピートと対応するDNA配列との間のこの単純な1対1の対応により、新しいDNA配列を認識するリピートアレイの組み立てプロセスは簡単になります。これらのTALEは、DNAヌクレアーゼFokIの触媒ドメインに融合して、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を生成することができます。結果として得られるTALEN構築物は特異性と活性を兼ね備えており、あらかじめ選択された部位でのみDNA配列に結合して切断する、設計された配列特異的ヌクレアーゼを効果的に生成します。 TALENの標的認識システムは、予測しやすいコードに基づいています。TALヌクレアーゼは、30塩基対以上の結合部位の長さなどにより、標的に特異的です。TALENは、ゲノム全体の任意の単一ヌクレオチドから6塩基対の範囲内で実行できます。[ 45 ]
TALENコンストラクトは、設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼと同様の方法で使用され、標的変異誘発において3つの利点があります。(1) DNA結合特異性が高い、(2)オフターゲット効果が低い、(3) DNA結合ドメインの構築が容易である。
CRISPR （クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列）は、細菌がウイルスから身を守るための獲得免疫の一種として利用する遺伝要素です。これらは、ウイルスゲノムに由来し、細菌ゲノムに組み込まれた短い配列で構成されています。Cas（CRISPR関連タンパク質）はこれらの配列を処理し、一致するウイルスDNA配列を切断します。Cas遺伝子と特別に構築されたCRISPRを含むプラスミドを真核細胞に導入することで、真核ゲノムを任意の任意の位置で切断することができます。[ 46 ]
以前は、より大きな改変は非効率的でエラーが発生しやすかったが、最近の技術開発により、かなり信頼性の高い大きな改変が可能になった。例えば、クアドラプルペグRNA戦略（QuadPE）により、研究者は1.6～26kbの大きなDNA断片を約40%の効率でヒト細胞に安定的に挿入することができた。[ 47 ]
塩基編集は、ゲノム編集の最も初期かつ最も効率的な方法の 1 つです。単一のヌクレオチド塩基の正確な編集にのみ適していますが、ゲノム DNA 鎖の切断と再結合を必要としないため、ヌクレオチド配列の挿入または除去よりも信頼性が高いです。したがって、これらの手順に伴うランダムな挿入と欠失を回避します。[ 4 ] [ 5 ] 核酸ガイド配列によって指示される核酸塩基修飾酵素を使用します。1990 年代に初めて記述されましたが、最近再び注目を集めています。[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 4 ]
ARCUTは人工制限DNAカッターの略で、小宮山誠によって開発された技術です。この方法は、擬似相補ペプチド核酸（pcPNA）を使用して染色体内の切断部位を特定します。pcPNAが部位を特定すると、スプライシング機能を実行するセリウム（CE）とEDTA（化学混合物）によって切除が行われます。[ 48 ]
メガヌクレアーゼ法による遺伝子編集は、上記の方法の中で最も効率が悪い。DNA結合要素と切断要素の性質上、1,000ヌクレオチドごとに1つの潜在的な標的しか認識できない。[ 15 ] ZFNは、メガヌクレアーゼの限界を克服するために開発された。ZFNが認識できる標的の数は、140ヌクレオチドごとに1つに増加した。[ 15 ]しかし、どちらの方法もDNA結合要素が互いに影響し合うため予測不可能である。その結果、高度な専門知識と、長くて費用のかかる検証プロセスが必要となる。
TALEヌクレアーゼは最も精密かつ特異的な方法であり、これまでの2つの方法よりも高い効率を実現します。これは、DNA結合要素がTALEサブユニットのアレイで構成されており、各サブユニットが他のサブユニットとは独立して特定のDNAヌクレオチド鎖を認識する能力を持つため、高精度でより多くの標的部位が得られるからです。新しいTALEヌクレアーゼの作成には、分子生物学とタンパク質工学の専門知識が必要で、約1週間と数百ドルかかります。[ 15 ]
CRISPRヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼと比較すると精度がやや低い。これは、CRISPRが誘導する二本鎖切断を修復するために使用するガイドRNAを生成するために、一方の端に特定のヌクレオチドが必要であるためである。最も迅速かつ安価な方法であることが示されており、費用は200ドル未満で、数日の時間しかかからない。[ 15 ] CRISPRは、設計がタンパク質ではなくガイドRNAにあるため、分子生物学の専門知識も最も少なくて済む。CRISPRがZFN法やTALEN法よりも優れている点の1つは、約80ntのCRISPR sgRNAを使用して異なるDNA配列を標的にすることができることである。一方、ZFN法とTALEN法は、それぞれのDNA配列を標的にするために作成されたタンパク質の構築とテストが必要であった。[ 49 ]
活性ヌクレアーゼのオフターゲット活性は遺伝子レベルおよび生物レベルで潜在的に危険な結果をもたらすため、メガヌクレアーゼ、ZFN、CRISPR、およびTALENベースの融合の精度は活発な研究分野となっている。報告されている数値は様々であるが、ZFNはTALEN法やRNA誘導ヌクレアーゼよりも細胞毒性が高い傾向があり、TALENおよびRNA誘導アプローチは最も効率が高く、オフターゲット効果が少ない傾向がある。[ 50 ] DNA結合とヌクレアーゼ活性の間の理論上の最大距離に基づくと、TALENアプローチは最も高い精度をもたらす。[ 15 ]
ゲノムの多様性とそれに関連する可能性のあるすべての表現型を研究したい科学者や研究者にとっての方法は非常に遅く、高価で、非効率的でした。この新しい革命以前は、研究者は単一遺伝子の操作を行い、ゲノムを一度に小さなセクションごとに微調整し、表現型を観察し、別の単一遺伝子の操作でプロセスを最初からやり直す必要がありました。[ 51 ]そこで、ハーバード大学のワイス研究所の研究者は、生体内ゲノム編集のプロセスを改善する強力な技術であるMAGEを設計しました。これにより、小さなキッチンテーブルの上に置くことができるほど小さな機械で、ゲノムの迅速かつ効率的な操作が可能になります。これらの変異は、細胞分裂中に自然に発生する変異と組み合わさり、数十億の細胞変異を生み出します。
化学的に結合した合成一本鎖DNA（ssDNA）とオリゴヌクレオチドのプールを細胞の標的領域に導入することで、遺伝子改変が行われます。この周期的なプロセスでは、ssDNAの変換（エレクトロポレーションによる）に続いて細胞増殖が行われ、その過程でバクテリオファージ相同組換えタンパク質がssDNAをゲノム標的にアニーリングさせます。選択的表現型マーカーを標的とした実験は、細胞を異なる培地に播種することでスクリーニングおよび同定されます。各サイクルの処理には最終的に2.5時間かかり、同質遺伝子培養の増殖と変異の特性評価にはさらに時間が必要です。複数の部位を標的とする変異誘発性ssDNAライブラリーを繰り返し導入することで、MAGEは細胞集団に組み合わせ遺伝的多様性を生み出すことができます。単一のヌクレオチド塩基対からゲノム全体または遺伝子ネットワークまで、最大50個のゲノム編集を同時に行うことができ、結果は数日で得られます。[ 51 ]
MAGE実験は、規模と複雑さの度合いによって3つのクラスに分類できます。(i) 多数の標的部位、単一の遺伝子変異。(ii) 単一の標的部位、多数の遺伝子変異。(iii) 多数の標的部位、多数の遺伝子変異。[ 51 ]クラス3の例は2009年に示されました。Churchらは、大腸菌をプログラムして、トマトの種子に通常含まれ、抗がん作用と関連付けられている抗酸化物質であるリコピンを通常の5倍の量で生産することに成功しました。彼らは、大腸菌の1-デオキシ-D-キシロース5-リン酸(DXP)代謝経路を最適化してイソプレノイドであるリコピンを過剰生産するためにMAGEを適用しました。これには約3日間と1,000ドル強の材料費がかかりました。 MAGEがゲノムを改変する際の容易さ、速さ、そしてコスト効率の良さは、バイオエンジニアリング、バイオエネルギー、生物医学工学、合成生物学、製薬、農業、化学産業における重要な化合物の製造・生産に対する産業界のアプローチを変革する可能性を秘めている。
2012年現在、効率的なゲノム編集は、植物から動物まで、臨床的関心を超えて、幅広い実験システム向けに開発されており、研究室で標準的な実験戦略になりつつある。[ 52 ]ラット、ゼブラフィッシュ、トウモロコシ、タバコのZFN媒介変異体の最近の生成とTALENベースのアプローチの改良は、この方法の重要性を証明しており、リストは急速に拡大している。人工ヌクレアーゼによるゲノム編集は、植物や動物の遺伝子機能の研究からヒトの遺伝子治療まで、生命科学の多くの分野に貢献する可能性が高い。たとえば、新しい機能を実行するように細胞や生物を設計することを目指す合成生物学の分野は、ゲノム要素を追加または削除して複雑なシステムを作成する人工ヌクレアーゼの能力から恩恵を受ける可能性が高い。[ 52 ]さらに、遺伝子機能は、人工ヌクレアーゼを使用して幹細胞を使用して研究することができる。
この方法で実行できる具体的なタスクを以下に示します。
遺伝子工学、特に遺伝子編集における最近の発見と、ウシの生殖技術（例えば体外胚培養）の最新の改良との組み合わせにより、合成の高特異性エンドヌクレアーゼを使用して受精卵母細胞内で直接ゲノム編集が可能になりました。RNA誘導エンドヌクレアーゼ：クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドロームリピート関連Cas9（CRISPR/Cas9）は新しいツールであり、利用可能な方法の範囲をさらに広げています。特に、CRISPR/Cas9で設計されたエンドヌクレアーゼは、哺乳類の接合子への細胞質直接注入（CDI）により、1ステップで複数のガイドRNAを使用して同時ノックアウト（KO）を可能にします。[ 53 ]
さらに、遺伝子編集は、大西洋サケなどの養殖魚の特定の種類にも適用できます。魚の遺伝子編集は現在実験段階ですが、成長、病気への抵抗力、不妊、繁殖の制御、体色などの可能性を秘めています。これらの形質を選択することで、より持続可能な環境と魚の福祉の向上が可能になります。[ 54 ]
アクアアドバンテージサーモンは、アクアバウンティテクノロジーズによって開発された遺伝子組み換え大西洋サケです。大西洋サケの成長ホルモン調節遺伝子は、太平洋キングサーモンの成長ホルモン調節遺伝子とオーシャンパウトのプロモーター配列に置き換えられています[ 55 ]。
単一細胞トランスクリプトミクス、ゲノム編集、新しい幹細胞モデルの並行的な発展のおかげで、機能遺伝学が動物モデルに限定されず、ヒトサンプルで直接実施できるという、科学的に刺激的な時代に突入しています。単一細胞遺伝子発現解析により、ヒト発生の転写ロードマップが解明され、そこから機能研究のための重要な候補遺伝子が特定されています。グローバルなトランスクリプトミクスデータを使用して実験をガイドすることで、CRISPRベースのゲノム編集ツールにより、ヒト環境で機能を解明するために重要な遺伝子を破壊または除去することが可能になりました。[ 56 ]
メガヌクレアーゼ[ 57 ]、 ZFN、およびTALENを用いたゲノム編集は、植物の遺伝子操作のための新しい戦略を提供し、内在遺伝子を改変することによって望ましい植物形質のエンジニアリングに役立つ可能性が高い。たとえば、主要な作物種における部位特異的な遺伝子導入は、「形質スタッキング」に使用でき、これにより、育種プロセス中にそれらの共分離を確実にするために、複数の望ましい形質が物理的に連結される。[ 41 ]このようなケースでの進歩は、最近、シロイヌナズナ[ 58 ] [ 59 ] [ 60 ]およびトウモロコシで報告されている。シロイヌナズナでは、ZFN支援遺伝子ターゲティングを使用して、2つの除草剤耐性遺伝子（タバコアセトラクテートシンターゼSuRAおよびSuRB）が、変異を持つ形質転換細胞が最大2%でSuR遺伝子座に導入された。[ 58 ] Zea maysでは、ZFN 誘導 DSB とそれに伴う NHEJ によって標的遺伝子座の破壊が達成された。この場合、 ZFN は除草剤耐性遺伝子発現カセット(PAT) を標的内在性遺伝子座 IPK1 に導入するためにも使用された。 [ 61 ]再生植物で観察されたこのようなゲノム改変は遺伝性であることが示され、次世代に伝達された。[ 61 ]作物改良におけるゲノム編集技術の応用の潜在的に成功した例はバナナに見られる。バナナでは、科学者がCRISPR/Cas9編集を使用してバナナ ( Musa spp. )の B ゲノム内の内在性バナナストリークウイルスを不活性化し、バナナ育種における大きな課題を克服した。[ 62 ]
さらに、TALENベースのゲノムエンジニアリングは、植物での使用に向けて広範囲にわたってテストされ、最適化されています。[ 63 ] TALEN融合体は、米国の食品原料会社Calyxt [ 64 ]によって、大豆油製品の品質向上[ 65 ]やジャガイモの貯蔵可能性の向上[ 66 ]にも使用されています。
ZFNを介したターゲティングを用いた植物ゲノム編集を改善するためには、いくつかの最適化が必要である。[ 67 ]ヌクレアーゼの信頼性の高い設計とその後のテスト、ヌクレアーゼの毒性の欠如、ターゲティングに適した植物組織の選択、酵素活性の誘導経路、オフターゲット変異誘発の欠如、および変異事例の信頼性の高い検出が必要である。[ 67 ]
植物におけるCRISPR/Cas9の一般的な導入方法は、アグロバクテリウムを用いた形質転換である。[ 68 ] T-DNAはT4SS機構によって植物ゲノムに直接導入される。Cas9およびgRNAベースの発現カセットはTiプラスミドに変換され、植物への適用のためアグロバクテリウムで形質転換される。[ 68 ]生きた植物へのCas9導入を改善するために、ウイルスがより効果的な遺伝子導入に使用されている。[ 68 ]
理想的な遺伝子治療とは、欠陥のある遺伝子を正常な対立遺伝子で本来の位置で置き換えることである。これは、ウイルスベクターで導入される遺伝子よりも有利である。なぜなら、多くの場合、遺伝子のごく一部だけを変更すればよい場合、完全なコード配列と調節配列を含める必要がないからである。[ 69 ] [ 70 ]また、部分的に置き換えられた遺伝子の発現は、ウイルスベクターによって運ばれる完全な遺伝子よりも、正常な細胞生物学により合致している。
TALENベースのゲノム編集の最初の臨床使用は、2015年に11ヶ月の子供のCD19+急性リンパ芽球性白血病の治療であった。改変されたドナーT細胞は、白血病細胞を攻撃し、アレムツズマブに耐性を持ち、導入後に宿主免疫系による検出を回避するように設計された。[ 71 ] [ 72 ]
CRISPR-Cas9を用いた細胞や動物における広範な研究が行われ、ダウン症候群、二分脊椎、無脳症、ターナー症候群、クラインフェルター症候群などの遺伝性疾患を引き起こす遺伝子変異を修正しようと試みられてきた。[ 73 ]
2019年2月、カリフォルニア州リッチモンドに本社を置くサンガモ・セラピューティクスの医療科学者らは、ハンター症候群の患者において、DNAを永久的に改変する史上初の「体内」ヒト遺伝子編集療法を発表した。[ 74 ]サンガモによるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いた遺伝子編集に関する臨床試験は進行中である。[ 75 ]
研究者らは、マラリアの媒介蚊であるガンビアハマダラカの不妊に関連する遺伝子を改変するために、 CRISPR-Cas9遺伝子ドライブを使用してきた。[ 76 ]この技術は、黄熱病、デング熱、ジカ熱などの他の媒介性疾患の根絶にも応用できる可能性がある。[ 77 ]
CRISPR-Cas9システムは、臨床遺伝子型や疫学的分離株を標的とすることで、あらゆる細菌種の個体数を調節するようにプログラムできます。病原体を排除することで、有害な細菌種よりも有益な細菌種を選択的に活性化できるため、広範囲の抗生物質よりも優位性があります。[ 51 ]
HIV、ヘルペス、B型肝炎ウイルスなどのヒトウイルスを標的とした治療のための抗ウイルス応用が研究されている。CRISPRは、ウイルスまたは宿主を標的として、ウイルスの細胞表面受容体タンパク質をコードする遺伝子を破壊するために使用できる。[ 49 ] 2018年11月、賀建奎は、 HIVが細胞に侵入するために使用する受容体をコードするCCR5遺伝子を不活性化しようとして、2つのヒト胚を編集したと発表した。彼は、数週間前に双子の女児、ルルとナナが生まれたと述べた。彼は、女児は機能的なCCR5のコピーと不活性化されたCCR5（モザイク現象）の両方を持っており、依然としてHIVに感染しやすいと述べた。この研究は、非倫理的で危険で時期尚早であるとして広く非難された。[ 78 ]
2019年1月、中国の科学者たちは、史上初のクローン猿である鍾鍾と華華、そして羊のドリーに使用されたのと同じクローン技術、そして史上初の遺伝子改変ヒトの赤ちゃんであるルルとナナの作製に何建奎が使用したとされるのと同じ遺伝子編集技術であるCrispr - Cas9を使用して、5匹の同一のクローン遺伝子編集猿を作製したと報告した。これらの猿のクローンは、いくつかの医学的疾患を研究するために作られた。[ 79 ] [ 80 ]
将来、人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集の研究における重要な目標は、ヌクレアーゼの作用の安全性と特異性を向上させることである。[ 81 ]例えば、オフターゲットイベントを検出する能力を向上させることで、それらを防止する方法について学ぶ能力を向上させることができる。さらに、ZFNで使用されるジンクフィンガーは完全に特異的であることはほとんどなく、毒性反応を引き起こす可能性がある。しかし、ZFNの切断ドメインに行われた変更によって毒性が軽減されることが報告されている。[ 70 ]
さらに、ダナ・キャロルによる人工ヌクレアーゼを用いたゲノム改変の研究は、DNAの基本的な組換えおよび修復機構のより深い理解の必要性を示している。将来的には、ZFNを発現する細胞から切断された末端を捕捉し、ハイスループットシーケンシングを用いて隣接するDNAを配列決定することで、二次標的を特定できる可能性がある。[ 70 ]
CRISPRは使いやすさとコスト効率の良さから、現在、広範な研究が行われています。CRISPRの発見は比較的最近であるにもかかわらず、現在ではZFNやTALENよりもCRISPRに関する論文の方が多くなっています。[ 49 ] CRISPRとTALENはどちらも、その精度と効率性から、大規模生産に導入される選択肢として好まれています。
ゲノム編集は、人工的な遺伝子工学を用いなくても、自然なプロセスとして起こる。遺伝子コードを編集する能力を持つ因子は、ウイルスまたは亜ウイルスRNA因子である。
DNAは逆遺伝学の他の多くの方法よりも効率が高いものの、それでも効率はそれほど高くなく、多くの場合、処理された集団の半分以下しか目的の変化を得られません。[ 58 ]例えば、細胞のNHEJを使用して突然変異を作ろうと計画している場合、細胞のHDRシステムもDSBを修復するために働き、突然変異率は低くなります。
従来、マウスは疾患モデルの宿主として研究者にとって最も一般的な選択肢でした。CRISPRは、ブタ、イヌ、非ヒト霊長類などの大型動物で遺伝子組み換え疾患モデルを作成することで、このモデルとヒト臨床試験との間のギャップを埋めるのに役立ちます。[ 82 ] [ 83 ] CRISPR-Cas9システムを使用すると、プログラムされたCas9タンパク質とsgRNAを受精卵に直接導入して、げっ歯類で遺伝子組み換えモデルを作成する際に目的の遺伝子改変を実現できます。これにより、遺伝子組み換え系統を生成する際の通常の細胞ターゲティング段階をスキップすることができ、結果として世代時間を90%短縮できます。[ 83 ]
CRISPRの有効性によってもたらされる可能性の一つは、異種移植への応用です。これまでの研究試験では、CRISPRは内在性レトロウイルスを標的として排除する能力を示しており、これにより病気の伝染リスクが低減し、免疫障壁が軽減されます。[ 49 ]これらの問題を解消することで、ドナー臓器の機能が向上し、この応用が現実のものに近づきます。
植物においては、ゲノム編集は生物多様性の保全に対する有効な解決策と見なされている。遺伝子ドライブは侵入種の繁殖率を変化させる可能性のあるツールであるが、重大なリスクが伴う。[ 84 ]
多くのトランスヒューマニストは、ゲノム編集を人間の能力向上に利用できるツールと見なしている。[ 85 ] [ 86 ] [ 87 ]オーストラリアの生物学者で遺伝学教授のデイビッド・アンドリュー・シンクレアは、「ゲノム編集の新しい技術は、個人に適用して（…）より健康な子供（デザイナーベビー）を産むことを可能にするだろう」と述べている。[ 88 ] 2016年9月のナフィールド生命倫理評議会の報告書によると、将来、他の生物の遺伝子や完全に合成された遺伝子を用いて、例えば夜間視力や嗅覚を向上させるなど、人間を能力向上させることが可能になるかもしれない。[ 89 ] [ 90 ]ジョージ・チャーチは、睡眠時間の短縮、アルツハイマー病から身を守る認知関連の変化、病気への抵抗力、学習能力の向上など、おそらく有利な特性のための潜在的な遺伝子改変のリストと、関連する研究や潜在的な悪影響の一部をまとめている。[ 91 ] [ 92 ]
米国科学アカデミーと米国医学アカデミーは、2017年2月にヒトゲノム編集に対する限定的な支持を与える報告書を発表した。[ 93 ]安全性と有効性の問題に対する解決策が見つかれば、ゲノム編集の臨床試験はいつか許可されるかもしれないが、「厳格な監視下での重篤な疾患に限る」と勧告した。[ 94 ]
米国情報機関の2016年世界脅威評価報告書において、米国国家情報長官ジェームズ・R・クラッパーは、ゲノム編集を大量破壊兵器の可能性のあるものとして挙げ、規制や倫理基準が「西側諸国とは異なる」国々がゲノム編集を行うことは、有害な生物剤や生物製品が作られるリスクを高める可能性があると述べた。同報告書によれば、この技術の広範な普及、低コスト、開発の加速化により、意図的または非意図的な悪用は、経済と国家安全保障に広範囲にわたる影響を及ぼす可能性がある。[ 95 ] [ 96 ] [ 97 ]例えば、CRISPRなどの技術は、「殺人蚊」を作ったり、主要作物を全滅させる疫病を引き起こしたり、非常に致死性の高いウイルスを作ったりするために使用される可能性がある。[ 97 ]
2016年9月にナフィールド生命倫理評議会が発表した報告書によると、遺伝子コードを編集するツールの簡便性と低コスト化により、アマチュア、いわゆる「バイオハッカー」が自ら実験を行うことが可能になり、遺伝子組み換え生物の放出による潜在的なリスクが生じる可能性がある。また、この報告書では、人のゲノムを改変すること、そしてその変化が次世代に受け継がれることのリスクとメリットは非常に複雑であり、緊急の倫理的検討が必要であると指摘している。こうした改変は、意図しない結果をもたらし、改変された遺伝子が精子や卵子にも含まれるため、子供本人だけでなく、その子孫にも害を及ぼす可能性がある。[ 89 ] [ 90 ] 2001年、オーストラリアの研究者ロナルド・ジャクソンとイアン・ラムショーは、オーストラリアの主要な害獣であるネズミを不妊症を引き起こすように改変したネズミ痘ウイルスに感染させることでネズミを制御する可能性を探った論文を『 Journal of Virology』に発表したことで批判された。提供された機密情報が、潜在的なバイオテロリストによる生物兵器の製造につながり、彼らはその知識を利用して、天然痘などの他の痘ウイルスのワクチン耐性株を作成し、人間に影響を与える可能性があるからである。[ 90 ] [ 98 ]さらに、遺伝子ドライブを野生の個体群に放出することによる生態学的リスクについても懸念がある。[ 90 ] [ 99 ] [ 100 ]
2007年、マリオ・カペッキ、マーティン・エバンス、オリバー・スミシーズは、「胚性幹細胞を用いてマウスに特定の遺伝子改変を導入する原理を発見した」功績により、ノーベル生理学・医学賞を授与された。[ 27 ]
2020年、ノーベル化学賞は「ゲノム編集法の開発」によりエマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・ダウドナに授与された。 [ 101 ]
「WHOがヒトゲノム編集に関するグローバルレジストリを立ち上げ」PharmaBiz、2019年8月31日。Gale General OneFile、2020年4月27日アクセス。