遺伝子ターゲティング

遺伝子ターゲティングは、生物のDNA配列を変更するために使用されるバイオテクノロジーツールです（したがって、ゲノム編集の一種です）。これは、相同組換えを含む相同性指向修復（HDR）という自然なDNA修復機構に基づいています。遺伝子ターゲティングは、生物に新しい遺伝子全体を挿入するような大きなDNA編集から、既存のDNAに対する単一塩基対の変更のようなはるかに小さな変更まで、さまざまなサイズのDNA編集を行うために使用できます。遺伝子ターゲティングは、ユーザーが定義した編集をDNAに導入するために修復テンプレートの存在に依存します。ユーザー（通常は科学者）は、編集したいDNA領域に対応する（相同な）DNA配列に挟まれた、目的の編集を含む修復テンプレートを設計します。したがって、編集は特定のゲノム領域にターゲットされます。このように、遺伝子ターゲティングは、姉妹染色分体の「自然な」DNA修復テンプレートを用いて切断されたDNAを修復する自然な相同組換え修復とは異なります（姉妹染色分体は遺伝子の2番目のコピーです）。生物のDNA配列の改変は、例えば遺伝子の生物学的役割を理解するための研究分野と、例えば生物の形質を改変するためのバイオテクノロジー分野（例えば作物の改良）の両方において有用です。

遺伝子標的生物を作るには、DNAをその細胞に導入する必要があります。このDNAには、遺伝子標的化を完了するために必要なすべての要素が含まれていなければなりません。最低限必要なのは、標的領域と相同な（配列が同一の）DNA領域に挟まれた目的の編集を含む相同修復テンプレートです（これらの相同領域は「相同アーム」と呼ばれます）。多くの場合、レポーター遺伝子や選択マーカーも必要となり、実際に遺伝子標的化が起こった細胞（または「イベント」）を特定して選択するのに役立ちます。また、標的DNA領域に二本鎖切断（DSB）を引き起こすことで遺伝子標的化率を高めることも一般的です。^{[ 2 ]}したがって、目的の部位特異的ヌクレアーゼをコードする遺伝子も、修復テンプレートとともに形質転換されることがあります。遺伝子標的化に必要なこれらの遺伝要素は、細菌における従来の分子クローニングによって組み立てることができます。

遺伝子ターゲティング法は、いくつかのモデル生物で確立されており、使用する種によって異なる場合がある。マウスの遺伝子をターゲティングするには、培養中のマウス胚性幹細胞にDNAを挿入する。挿入された細胞は、胚への注入によってマウスの組織に寄与することができる。最終的に、改変された細胞が生殖器官を構成するキメラマウスが作出される。この段階を経て、マウスの全身は選択された胚性幹細胞に基づいて形成される。

コケの遺伝子を標的とするには、DNAを新鮮に分離したプロトプラストとポリエチレングリコールとともにインキュベートします。コケは半数体生物であるため、^{[ 3 ]}コケの糸状体（原糸体）は、抗生物質処理またはPCRによって直接標的をスクリーニングできます。植物の中では珍しいこの逆遺伝学の手順は、酵母の場合と同じくらい効率的です。^{[ 4 ]}遺伝子ターゲティングは、牛、羊、豚、および多くの真菌に成功裏に適用されています。

遺伝子ターゲティングの頻度は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ^{[ 5 ]}、人工ホーミングエンドヌクレアーゼ^{[ 6 ]}、TALEN、または最も一般的なCRISPR -Casシステムなどの部位特異的エンドヌクレアーゼを使用することで大幅に向上させることができます。この方法は、ショウジョウバエ^{[ 5 ]}、タバコ^{[ 7 ] [ 8 ]}、トウモロコシ^{[ 9 ]} 、ヒト細胞^{[ 10} ] 、マウス^{[ 11 ]}、ラット^{[ 11 ]}などの種に適用されてい^ます。

遺伝子ターゲティング、遺伝子編集、遺伝子改変の関係は、以下のベン図に示されています。この図は、「遺伝子工学」がこれら 3 つの技術すべてを包含していることを示しています。ゲノム編集は、特定の場所でゲノムに小さな編集を加えることで特徴付けられ、多くの場合、CRISPR などの部位特異的ヌクレアーゼによって標的 DNA 領域を切断した後に行われます。^{[ 12 ]}遺伝子改変は通常、トランスジーン (外来 DNA、つまり別の種の遺伝子) をゲノム内のランダムな場所に挿入することを指します。^{[ 13 ] [ 14 ]}遺伝子ターゲティングは、特定の場所でゲノムに小さな変化をもたらすことができる特定のバイオテクノロジー ツールです^{[ 2 ]} - この場合、遺伝子ターゲティングによって引き起こされる編集は、ゲノム編集としてカウントされます。ただし、遺伝子ターゲティングは、トランスジーンが遺伝子ターゲティング中に使用される相同修復テンプレートに組み込まれている場合、標的部位に遺伝子全体 (トランスジーンなど) を挿入することもできます。^{[ 15 ] [ 16 ]}このような場合、遺伝子ターゲティングによって引き起こされる編集は、一部の法域では、外来DNAの挿入が行われたため、遺伝子改変と同等とみなされるだろう。^{[ 16 ]}

遺伝子ターゲティングは、ゲノム編集ツールの特定の形態の1つです。他のゲノム編集ツールには、標的変異誘発、塩基編集、およびプライム編集があり、これらはすべて、特定のゲノム位置で内在性DNA（生物に既に存在するDNA）に編集を加えます。^{[ 17 ] [ 18 ]}この部位特異的または「標的」のゲノム編集の性質が、ゲノム編集を、生物のゲノムの非特定の場所にトランスジーンを挿入する従来の「遺伝子改変」や、生物に既に存在するDNAに小さな編集を加える遺伝子編集と、別の種からの「外来」DNAを挿入する遺伝子改変との違いを生じさせています。^{[ 19 ] [ 20 ]}

遺伝子編集は内在性DNAに小さな変化をもたらすため、ゲノム編集によって生じる多くの突然変異は、理論的には自然突然変異誘発によって、あるいは植物の文脈では、従来の育種の一部である突然変異育種によって起こり得る（対照的に、遺伝子組み換え生物（GMO）を作成するためのトランスジーンの挿入は自然には起こり得ない）。しかし、この一般的な規則には例外がある。序論で説明したように、GTは、1塩基対の変更、挿入、または削除などの非常に小さな編集から、理論的にはトランスジーン全体の挿入を含む、はるかに長いDNA配列の挿入まで、DNAにさまざまなサイズの編集を導入することができる。^{[ 16 ]}しかし、実際には、GTはより小さな配列を挿入するためによく使用される。GTによって可能な編集の範囲は、規制を困難にする可能性がある（規制を参照）。

遺伝子編集の最も確立された2つの方法は、遺伝子ターゲティングと標的変異誘発です。遺伝子ターゲティングは相同組換え修復（HDR）（相同組換え、HRとも呼ばれる）DNA修復経路に依存していますが、標的変異誘発は切断されたDNAの非相同末端結合（NHEJ）を利用します。NHEJはエラーを起こしやすいDNA修復経路であり、切断されたDNAを修復する際にDNA塩基を挿入または削除し、挿入または削除（インデル）を引き起こす可能性があります。ユーザーはこれらのランダムなインデルが何であるかを指定できないため、標的部位でどのような編集が行われるかを正確に制御することはできません。しかし、標的部位でDNAを切断するために部位特異的ヌクレアーゼ（以前はジンクフィンガーヌクレアーゼおよびTALEN、現在は一般的にCRISPR）を使用することで、これらの編集が行われる場所（つまり標的部位）を制御することができます。下の図に、HDR（相同組換えとも呼ばれる）による遺伝子ターゲティングとNHEJによる標的変異誘発の概要を示します。

CRISPR-Cas法に基づく、より新しく開発されたプライム編集とベース編集^{[ 18 ]の遺伝子編集技術は、標的ゲノム位置にユーザーが定義した編集を作成することもできる遺伝子ターゲティングの代替手段である。しかし、それぞれ挿入可能なDNA配列の長さに制限がある。ベース編集は単一塩基対の変換に限定され[ 21 ]}、プライム編集は最大約44bpの配列しか挿入できない^{[ 22 ] [ 23 ]} 。したがって、GTはゲノムエンジニアリングのための長いDNA配列の標的（位置特異的）挿入の主要な方法であり続けている。  

遺伝子トラッピングはカセットのランダム挿入に基づくのに対し、遺伝子ターゲティングは特定の遺伝子を操作する。カセットは様々な用途に使用できるが、遺伝子ターゲティングカセットの隣接相同領域は各遺伝子に合わせて調整する必要がある。このため、遺伝子トラッピングはターゲティングよりも大規模プロジェクトに適している。一方、遺伝子ターゲティングは、トラップスクリーニングでは検出されないような転写量の少ない遺伝子にも使用できる。トラッピングの確率はイントロンのサイズが大きくなるにつれて高くなるが、遺伝子ターゲティングでは小さな遺伝子でも容易に改変できる。

マリオ・R・カペッキ、マーティン・J・エバンス、オリバー・スミシーズは、「胚性幹細胞を用いてマウスに特定の遺伝子改変を導入する原理」、すなわち遺伝子ターゲティングに関する研究で、 2007年のノーベル生理学・医学賞を受賞した。^{[ 49 ]}

前述のように、遺伝子ターゲティングは、単一塩基対変異から、潜在的にトランスジーンを含むより長い配列の挿入まで、さまざまなサイズの遺伝子変化を技術的に作成できます。これは、遺伝子ターゲティングの産物が自然変異と区別できない場合や、トランスジーンの挿入によりGMOと同等になる場合があることを意味します（上記のベン図を参照）。したがって、遺伝子ターゲティングの産物を規制することは困難であり、各国は異なるアプローチをとっているか、遺伝子編集の産物に対するより広範な規制レビューの一環として、その方法を検討しています。^{[ 50 ] [ 51 ] [ 52 ]}広く採用されている分類では、遺伝子編集された生物は、遺伝子編集された生物を生成するために使用される部位指向性ヌクレアーゼ（CRISPR-Casなど）を指す「SDN1-3」の3つのクラスに分けられています。^{[ 53 ] [ 16 ]}これらの SDN 分類は、どのクラスの SDN を「GMO」とみなすか、したがってどのクラスが潜在的に厳しい規制の対象となるかについて、国の規制の指針となる。 

• SDN1とは、SDNが触媒するDNA切断部位の非相同末端結合によって作製された生物のことである。そのため、エラーを起こしやすいNHEJによってランダムな突然変異が生じ、修復テンプレートは使用されていない（したがって、遺伝子ターゲティングではない）。DNA修復テンプレートを使用しないこと、および従来の育種技術（植物育種の場合）と同等であることから、規制上の監視が比較的緩やかになることが多い。
• SDN2 = 相同修復テンプレートを使用して、SDN切断部位の標的遺伝子に1つまたは複数の特定の変異が導入されています（これが遺伝子ターゲティングです）。
• SDN3 = 相同組換え（すなわち遺伝子ターゲティング）またはNHEJを介して、切断部位に長い配列が挿入されている。^{[ 16 ]}「長い配列」とは、通常、プロモーターやタンパク質コード領域などの遺伝要素全体を指す。これらはしばしばトランスジェニックとみなされ、そのためGMOに分類されることが多い。^{[ 54 ]}

歴史的に、欧州連合（EU）は予防原則に基づき、遺伝子組み換え技術に概ね反対してきた。2018年、欧州司法裁判所（ECJ）は、遺伝子編集作物（遺伝子標的作物を含む）は遺伝子組み換え作物とみなされるべきであるとの判決を下し^{[ 55 ]}、したがって、遺伝子組み換え作物の使用に重大な規制上の負担を課すGMO指令の対象となるとした。しかし、この判決は欧州の科学界から否定的に受け止められた^{[ 56 ]} 。 2021年、欧州委員会は、遺伝子組み換えおよび遺伝子編集技術（またはNGT - 新ゲノム技術）を規制する現在のEU法は「目的に適していない」ため、科学技術の進歩を反映するように修正する必要があると判断した^{[ 57 ]} 。 2023年7月、欧州委員会は、遺伝子編集によって開発された生物のうち、自然に起こり得た遺伝子変化を含むものに対する規制要件を軽減するために、特定の遺伝子編集製品に関する規則を変更する提案を発表した^{[ 58 ] 。}

• Creリコンビナーゼ
• Cre-Lox組換え
• FLP-FRT組換え
• 遺伝子組み換え
• 組換え酵素を介したカセット交換（既存の「遺伝子カセット」を「目的遺伝子」と交換すること）
• 遺伝子工学の規制
• 部位特異的組換え酵素技術
• Toll様受容体（解析対象遺伝子の例）
• マウス（ハツカネズミ；一般的なモデル生物）
• Physcomitrella patens（1998年時点で遺伝子ターゲティングが可能な唯一の植物^{[ 59 ]}）

• ミシガン大学による遺伝子ターゲティングの概要
• マウスにおける遺伝子ターゲティングの図解と概要（ヘイダリ研究室、ウェイン州立大学）
• 遺伝子ターゲティングに用いられるレポーター遺伝子に関する研究ハイライト（2008年8月19日、 Wayback Machineにアーカイブ済み）
• 大麦における標的遺伝子置換