亜鉛フィンガーヌクレアーゼ

個々の ZFN の DNA 結合ドメインは、通常 3 ～ 6 個の個々のジンクフィンガーリピートを含み、それぞれが 9 ～ 18 塩基対を認識できます。ジンクフィンガードメインが 3 塩基対の DNA 配列を完全に認識する場合、9 塩基対の標的部位を認識できる 3 フィンガーアレイを生成できます。他の手順では、1 フィンガーまたは 2 フィンガーモジュールを使用して、6 個以上の個々のジンクフィンガーを持つジンクフィンガーアレイを生成できます。この手順の主な欠点は、個々のジンクフィンガーの特異性が重複し、周囲のジンクフィンガーと DNA のコンテキストに依存する可能性があることです。この「コンテキスト依存性」を考慮する方法がない場合、標準的なモジュールアセンブリ手順はしばしば失敗します。^{[ 1 ]}

目的の配列を標的とする亜鉛フィンガーアレイを生成するために、数多くの選択方法が用いられてきた。初期の選択の試みでは、ファージディスプレイを用いて、部分的にランダム化された多数の亜鉛フィンガーアレイから、特定のDNA標的に結合するタンパク質を選択した。より最近の試みでは、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッドシステム、哺乳類細胞が利用されている。新規亜鉛フィンガーアレイを選択する有望な新しい方法は、細菌ツーハイブリッドシステムを利用しており、開発者によって「OPEN」と名付けられている。^{[ 2 ]}このシステムは、特定のトリプレットに結合するようにそれぞれ選択された個々の亜鉛フィンガーの事前選択されたプールを組み合わせ、2回目の選択ラウンドを利用して、目的の9 bp配列に結合できる3フィンガーアレイを取得する。このシステムは、市販の人工亜鉛フィンガーアレイの代替として、亜鉛フィンガーコンソーシアムによって開発された。

（亜鉛フィンガーの選択技術に関する詳細は、「亜鉛フィンガーキメラ」を参照してください。）

ZFNの切断ドメインとしては、通常、II型制限エンドヌクレアーゼFokIの非特異的切断ドメインが用いられる。^{[ 4 ]} この切断ドメインはDNAを切断するために二量体化する必要があるため^{[ 5 ]} 、非回文DNA部位を標的とするには一対のZFNが必要となる。標準的なZFNは、切断ドメインを各ジンクフィンガードメインのC末端に融合させる。2つの切断ドメインが二量体化してDNAを切断するためには、2つのZFNがC末端を一定の距離離してDNAの反対側の鎖に結合する必要がある。ジンクフィンガードメインと切断ドメインの間に最も一般的に使用されるリンカー配列では、各結合部位の5'末端が5～7 bp離れている必要がある。^{[ 6 ]}

ZFNで使用されるヌクレアーゼドメインの活性と特異性の両方を向上させるために、 いくつかの異なるタンパク質工学技術が用いられてきた。指向性進化は、著者らが「Sharkey」と名付けた、切断活性が強化されたFokI変異体を生成するために用いられた。^{[ 7 ]}また、構造に基づく設計も、二量体化界面を改変して、意図したヘテロ二量体種のみが活性となるようにすることで、FokIの切断特異性を向上させるために用いられてきた。^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

ZFNは、変異アレル内のDNAに二本鎖切断（DSB）（遺伝子組換えを参照）を生成することにより、ヘテロ接合個体の優性変異を無効にするために使用できます。相同テンプレートがない場合、 DSBは非相同末端結合（NHEJ）によって修復されます。NHEJは、2つの末端を結合することによってDSBを修復し、切断がきれいで複雑でない限り、通常は変異を生成しません。ただし、場合によっては、修復が不完全で、塩基対の欠失または挿入が発生し、フレームシフトが発生して、有害なタンパク質の生成が妨げられます。^{[ 33 ]}複数のZFNペアを使用して、ゲノム配列の大きなセグメント全体を完全に除去することもできます。^{[ 34 ]} 編集活性を監視するために、標的領域のPCRにより両方のアレルが増幅され、一方に挿入、欠失、または変異が含まれている場合、切断アッセイで容易に検出できるヘテロ二本鎖一本鎖バブルが生成される。ZFNは、トリプレットリピート疾患の疾患原因アレルを改変するためにも使用されている。CAG/CTGリピート配列の拡張は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、およびいくつかの脊髄小脳失調症を含む12以上の遺伝性神経疾患の遺伝的基盤となっている。ヒト細胞では、ZFNが二本鎖切断（DSB）をCAGリピートに誘導し、リピートを長い病理学的長さから短く毒性の低い長さに短縮できることが実証されている。^{[ 35 ]}

最近、研究者グループがZFN技術を用いてゼブラフィッシュ胚のgol色素遺伝子とntl遺伝子の遺伝子改変に成功した。特定のDNA配列を認識するように設計された特異的なジンクフィンガーモチーフが用いられた。ZFNをコードするmRNAを1細胞期の胚に注入したところ、多くの個体で目的の変異と表現型が発現した。この研究により、ZFNは生殖細胞系列の目的遺伝子座に特異的かつ効率的に遺伝可能な変異アレルを生成でき、ZFN誘導アレルは次世代に受け継がれることが実証された。

ゼブラフィッシュ胚に特定の変異を導入するためにZFNを使用する同様の研究は、他の研究グループによっても行われています。ゼブラフィッシュのkdr遺伝子は、血管内皮増殖因子-2受容体をコードしています。この標的部位に変異誘発病変を誘導するために、米国の研究者グループがZFN技術を使用しました。彼らは、ZFN技術によって標的アレル系列の変異体を容易に生成できること、種特異的な胚性幹細胞株の存在に依存せず、他の脊椎動物、特に胚が容易に入手できる動物にも適用できること、そして最後に、ゼブラフィッシュで標的ノックインを実現することも可能であるため、これまでアクセスできなかったヒト疾患モデルを作成できることを示唆しました。

ZFNは、供給されたDNA断片を鋳型として相同組換え（HR）機構を活性化させ、二本鎖切断（DSB）を修復することで、対立遺伝子の配列を書き換えるためにも使用されます。HR機構は、損傷した染色体と染色体外断片との間の相同性を探し、断片が元の配列を含んでいるかどうかに関わらず、断片の配列を染色体の2つの切断端の間にコピーします。対象者が標的対立遺伝子に関してホモ接合体である場合、供給された断片の代わりに損傷を受けていない対立遺伝子のコピーが修復の鋳型として使用される可能性があるため、この技術の効率は低下します。

遺伝子治療の成功は、細胞損傷、発がん性変異、または免疫応答を引き起こすことなく、ヒトゲノム内の適切な染色体標的部位に治療遺伝子を効率的に挿入できるかどうかにかかっています。プラスミドベクターの構築は簡単で分かりやすいです。Fok Iエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（N）とジンクフィンガータンパク質（ZFP）を組み合わせたカスタム設計のZFNは、ゲノムに部位特異的な二本鎖切断（DSB）を導入し、局所的な相同組換えを数桁も促進する一般的な方法を提供します。これにより、ヒト細胞における標的遺伝子修復またはゲノム編集が実現可能な選択肢となります。ZFNをコードするプラスミドは、ヒト細胞内の特定の遺伝子座にDSBを標的とするためにZFNを一時的に発現させるために使用できるため、治療遺伝子をあらかじめ選択された染色体部位に標的送達するための優れた方法を提供します。 ZFNをコードするプラスミドベースのアプローチは、治療遺伝子のウイルス送達に伴うすべての問題を回避できる可能性を秘めている。^{[ 36 ]} ZFNの最初の治療応用は、患者自身の幹細胞を用いた体外療法となる可能性が高い。幹細胞ゲノムを編集した後、細胞を培養で増殖させ、患者に再挿入することで、機能が修正された分化細胞を産生できる。最初の標的としては、遺伝子修正のためのIL2Rγ遺伝子やβ-グロビン遺伝子、変異誘発および機能不全のためのCCR5遺伝子など、単一遺伝子疾患の原因となる遺伝子が含まれる可能性が高い。^{[ 33 ]}

亜鉛フィンガードメインが標的部位に対して十分な特異性を持たない場合、または目的のゲノム内の固有の部位を標的としない場合、オフターゲット切断が発生する可能性がある。このようなオフターゲット切断は、修復機構を圧倒するほどの二本鎖切断の生成につながり、結果として染色体再編成や細胞死を引き起こす可能性がある。オフターゲット切断イベントは、ドナーDNAのランダムな組み込みを促進する可能性もある。^{[ 33 ]} 隣接する2つの9塩基対部位を標的とする3フィンガーZFNのオフターゲット切断を減少させる2つの異なる方法が実証されている。^{[ 37 ]} 他のグループは、より長く、おそらくよりまれな部位を標的とする4、5、または6つの亜鉛フィンガーを持つZFNを使用しており、このようなZFNは理論的にはオフターゲット活性を少なくすることができる。 3本指ZFNのペアと4本指ZFNのペアを比較したところ、ヒト細胞では3本指ZFNで31箇所、4本指ZFNで9箇所でオフターゲット切断が検出された。^{[ 38 ]} 5本指ZFNのペアで改変したC. elegansの全ゲノムシーケンス解析では、意図した改変と「ZFN部位とは無関係」の部位での欠失のみが見つかり、このZFNのペアがC. elegansゲノムの特定の部位を標的にできることが示された。^{[ 19 ]}

人体に挿入される多くの異種タンパク質と同様に、治療薬およびそれが作用する細胞に対する免疫反応のリスクがある。しかし、タンパク質は一時的にしか発現しないため、反応が生じる期間は短い。^{[ 33 ]}

Liuらはそれぞれ、内因性β-カゼイン(CSN2)遺伝子座にZFニッカーゼを標的とし、相同組換え修復によってリゾスタフィンとヒトリゾチーム遺伝子の付加を刺激し、リゾスタフィンを分泌するウシを誘導した。 ^{[ 39 ] [ 40 ]}