タンパク質工学

タンパク質工学は、非天然ポリペプチドの設計と生産を通じて、有用または価値のあるタンパク質を開発するプロセスであり、多くの場合、自然界に見られるアミノ酸配列を変更することによって行われます。^{[1]これは新しい分野であり、}タンパク質の折り畳みの理解とタンパク質設計原理の認識について多くの研究が行われています。これは、工業用触媒用の多くの酵素の機能を改善するために使用されています。^[2]これは製品とサービスの市場でもあり、2017年までに1680億ドルの価値があると推定されています。^[3]

タンパク質工学には、合理的タンパク質設計と指向性進化という 2 つの一般的な戦略があります。これらの方法は相互に排他的ではなく、研究者は両方を適用することがよくあります。将来的には、タンパク質の構造と機能に関するより詳細な知識と、ハイスループット スクリーニングの進歩により、タンパク質工学の能力が大幅に拡大する可能性があります。最終的には、遺伝コードに新しいアミノ酸をエンコードできる拡張遺伝コードなどの新しい方法により、非天然アミノ酸も含められる可能性があります。医療や産業用バイオプロセスを含む多くの分野での応用は広範かつ多岐にわたります。

合理的なタンパク質設計では、科学者はタンパク質の構造と機能に関する詳細な知識を利用して、望ましい変更を加えます。一般的に、部位特異的変異誘発法が十分に開発されているため、この方法は安価で技術的に簡単であるという利点があります。しかし、その大きな欠点は、タンパク質の詳細な構造知識がしばしば入手できないこと、また、たとえ入手できたとしても、構造情報はほとんどの場合、タンパク質構造の静的な画像を提供するため、さまざまな変異の影響を予測することが非常に難しいことです。しかし、Folding@homeやFolditなどのプログラムは、タンパク質の折り畳みモチーフに関する洞察を得るためにクラウドソーシング技術を利用しています。 ^[4]

計算によるタンパク質設計アルゴリズムは、事前に指定されたターゲット構造に折り畳まれたときにエネルギーが低い新しいアミノ酸配列を特定しようとします。検索する必要がある配列コンフォメーション空間は大きいですが、計算によるタンパク質設計の最も難しい要件は、最適な配列と類似の最適でない配列を区別できる高速かつ正確なエネルギー関数です。

タンパク質の構造情報がない場合、配列分析はタンパク質に関する情報を解明するのに役立つことが多い。これらの技術には、標的タンパク質配列を他の関連タンパク質配列とアラインメントすることが含まれる。このアラインメントにより、種間で保存されているアミノ酸とタンパク質の機能に重要なアミノ酸がわかる。これらの分析は、変異の標的部位となる可能性のあるホットスポットアミノ酸を特定するために役立つ。多重配列アラインメントでは、PREFAB、SABMARK、OXBENCH、IRMBASE、BALIBASE などのデータベースを使用して、標的タンパク質配列を既知の配列と相互参照する。多重配列アラインメント技術を以下に挙げる。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、 k-tuple法またはNeedleman-Wunsch法を使用して、シーケンスのペアワイズアライメントを実行することから始まります。これらの方法は、シーケンスペア間のペアワイズ類似性を表すマトリックスを計算します。類似性スコアは、次に距離スコアに変換され、近隣結合法を使用してガイドツリーを作成するために使用されます。このガイドツリーは、複数のシーケンスアライメントを生成するために使用されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、k-tuple法を利用して最大190,000の配列をアラインメントすることができます。次に、mBed法とk -means法を使用して配列をクラスタ化します。次に、HH alignパッケージで使用されるUPGMA法を使用してガイドツリーを構築します。このガイドツリーは、複数の配列アラインメントを生成するために使用されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、アミノ酸配列を各アミノ酸残基の体積と極性の値で構成される配列に変換する高速フーリエ変換（FFT）を利用する。この新しい配列は相同領域を見つけるために使用される。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、Wu-Manber近似文字列マッチングアルゴリズムを利用して、複数の配列アライメントを生成します。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、Kmer距離とKimura距離を利用して複数の配列アライメントを生成します。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、アラインメントの進化にツリーベースの一貫性目的関数を使用します。この方法は、Clustal Wよりも5〜10％正確であることが示されている。^{[5] [ページが必要]}

共進化解析は、相関変異、共変異、または共置換とも呼ばれます。このタイプの合理的設計には、進化的に相互作用する遺伝子座における相互進化変化が含まれます。通常、この方法は、ターゲット配列のキュレーションされた複数の配列アラインメントの生成から始まります。次に、このアラインメントは、ギャップの大きい配列や配列同一性の低い配列の除去を含む手動の改良にかけられます。このステップにより、アラインメントの品質が向上します。次に、手動で処理されたアラインメントは、個別の相関変異アルゴリズムを使用して、さらなる共進化測定に使用されます。これらのアルゴリズムにより、共進化スコアリング マトリックスが生成されます。このマトリックスは、さまざまな有意性テストを適用してフィルタリングされ、重要な共進化値を抽出し、バックグラウンド ノイズを消去します。共進化測定は、そのパフォーマンスと厳密性を評価するためにさらに評価されます。最後に、この共進化解析の結果は実験的に検証されます。^{[5] [ページが必要]}

タンパク質の新規生成は、既存のタンパク質構造の知識から恩恵を受けます。この既存のタンパク質構造の知識は、新しいタンパク質構造の予測に役立ちます。タンパク質構造予測の方法は、 アブイニシオ、フラグメントベースの方法、ホモロジーモデリング、およびタンパク質スレッディングの4つのクラスのいずれかに分類されます。^{[5] [ページが必要]}

これらの方法は、テンプレートの構造情報を一切使用せずに自由モデリングを行う。アブ イニシオ法は、自由エネルギーの最小値に対応するタンパク質のネイティブ構造を予測することを目的としています。アブ イニシオ法の例としては、AMBER、GROMOS、GROMACS、CHARMM、OPLS、ENCEPP12 などがあります。 アブ イニシオ法の一般的な手順は、対象となるタンパク質の幾何学的表現から始まります。次に、タンパク質のポテンシャル エネルギー関数モデルを作成します。このモデルは、分子力学ポテンシャルまたはタンパク質構造から導出されたポテンシャル関数を使用して作成できます。ポテンシャル モデルの作成後、分子動力学シミュレーション、モンテ カルロ シミュレーション、遺伝的アルゴリズムなどのエネルギー探索手法をタンパク質に適用します。^{[5] [ページが必要]}

これらの方法は、構造に関するデータベース情報を使用して、作成されたタンパク質配列に相同構造を一致させます。これらの相同構造は、スコアリングと最適化の手順を使用してコンパクトな構造に組み立てられ、最小のポテンシャルエネルギースコアを達成することを目的としています。フラグメント情報のWebサーバーは、I-TASSER、ROSETTA、ROSETTA @ home、FRAGFOLD、CABS fold、PROFESY、CREF、QUARK、UNDERTAKER、HMM、およびANGLORです。^{[5] : 72}

これらの方法は、タンパク質の相同性に基づいています。これらの方法は、比較モデリングとも呼ばれます。相同性モデリングの最初のステップは、通常、クエリ配列と相同な既知の構造のテンプレート配列を特定することです。次に、クエリ配列をテンプレート配列に整列させます。整列後、テンプレート構造を使用して構造的に保存された領域をモデル化します。次に、テンプレートとは異なる側鎖とループをモデル化します。最後に、モデル化された構造の改良と品質評価が行われます。相同性モデリング データに使用できるサーバーは、SWISS MODEL、MODELLER、ReformAlign、PyMOD、TIP-STRUCTFAST、COMPASS、3d-PSSM、SAMT02、SAMT99、HHPRED、FAGUE、3D-JIGSAW、META-PP、ROSETTA、および I-TASSER です。^{[5] [ページが必要]}

タンパク質スレッドは、クエリ配列の信頼できる相同体が見つからない場合に使用できます。この方法は、クエリ配列とテンプレート構造のライブラリを取得することから始まります。次に、クエリ配列を既知のテンプレート構造にスレッドします。これらの候補モデルは、スコアリング関数を使用してスコアリングされます。これらは、クエリ配列とテンプレート配列の両方のポテンシャルエネルギーモデルに基づいてスコアリングされます。次に、最も低いポテンシャルエネルギーモデルとの一致が選択されます。スレッドデータを取得して計算を実行するための方法とサーバーは、次のとおりです。GenTHREADER、pGenTHREADER、pDomTHREADER、ORFEUS、PROSPECT、BioShell-Threading、FFASO3、RaptorX、HHPred、LOOPP サーバー、Sparks-X、SEGMER、THREADER2、ESYPRED3D、LIBRA、TOPITS、RAPTOR、COTH、MUSTER。^{[5] [ページが必要]}

合理的設計の詳細については、部位特異的変異誘発を参照してください。

多価結合は、親和性効果を通じて結合特異性と親和性を高めるために使用できます。単一の生体分子または複合体に複数の結合ドメインがあると、個々の結合イベントを介して他の相互作用が発生する可能性が高くなります。親和性または有効親和性は、個々の親和性の合計よりもはるかに高くなる可能性があり、標的結合のためのコストと時間効率の高いツールを提供します。^[6]

多価タンパク質は、翻訳後修飾またはタンパク質コード DNA 配列の増幅によって比較的簡単に生成できます。多価および多重特異性タンパク質の主な利点は、既知のタンパク質のターゲットに対する有効な親和性を高めることができることです。不均質なターゲットの場合、多重特異性結合をもたらすタンパク質の組み合わせを使用すると、特異性を高めることができ、タンパク質治療に高い応用性があります。

多価結合の最も一般的な例は抗体であり、二重特異性抗体に関する研究は広範に行われている。二重特異性抗体の用途は、診断、画像診断、予防、治療など、広範囲に及ぶ。^{[7] [8]}

指向性進化では、エラーを起こしやすいPCRや配列飽和突然変異などによるランダム突然変異がタンパク質に適用され、選択レジームを使用して、望ましい形質を持つ変異体が選択されます。その後、突然変異と選択のさらなるラウンドが適用されます。この方法は自然進化を模倣しており、一般に合理的設計よりも優れた結果を生み出します。DNAシャッフルと呼ばれる追加のプロセスでは、成功した変異体の断片を混ぜ合わせて一致させ、より良い結果を生み出します。このようなプロセスは、有性生殖中に自然に発生する組み換えを模倣しています。指向性進化の利点は、タンパク質の構造に関する事前の知識を必要とせず、特定の突然変異がどのような効果をもたらすかを予測する必要がないことです。実際、指向性進化実験の結果は、望ましい変化が、何らかの効果をもたらすとは予想されていなかった突然変異によって引き起こされることが多いという点で、しばしば驚くべきものになります。欠点は、ハイスループットスクリーニングが必要になることですが、これはすべてのタンパク質で実行できるわけではありません。大量の組み換えDNAを突然変異させ、生成物を望ましい形質についてスクリーニングする必要があります。変異体の数が多いため、プロセスを自動化するには高価なロボット装置が必要になることが多く、さらに、必要なアクティビティのすべてを簡単にスクリーニングできるわけではありません。

自然のダーウィン進化論は、触媒を含む多様な用途に合わせてタンパク質の特性をカスタマイズする目的で、実験室で効果的に模倣できます。大規模で多様なタンパク質ライブラリを作成し、折り畳まれた機能的な変異体をスクリーニングまたは選択するための実験技術は数多く存在します。折り畳まれたタンパク質は、ランダムな配列空間で驚くほど頻繁に発生し、選択的な結合剤や触媒を進化させるのに利用できます。ランダムな突然変異誘発と選択/スクリーニングによる既存のタンパク質の再設計は、深い配列空間からの直接選択よりも保守的ですが、既存の特性を最適化または変更するための特に堅牢な方法です。また、より野心的なエンジニアリング目標を達成するための優れた出発点でもあります。実験的進化と現代の計算方法を結び付けることは、自然界に知られていない機能的な高分子を生成するための最も広範で実りある戦略である可能性があります。^[9]

高品質の変異体ライブラリを設計するという主な課題は、近年大きな進歩を遂げています。この進歩は、タンパク質特性に対する変異負荷の影響をより適切に記述するという形で表れています。また、計算手法は、無数に大きい配列空間をより扱いやすいスクリーニング可能なサイズに大きく進歩し、変異体のスマートライブラリを作成しています。また、体系的な組み換えのアルゴリズムを使用して重要な有益な残基を特定することで、ライブラリのサイズをよりスクリーニング可能なサイズに縮小しました。最後に、タンパク質機能に対する結合変異効果を定量化および予測するより正確な統計モデルとアルゴリズムの開発により、酵素の効率的な再エンジニアリングに向けて大きな前進を遂げました。^[10]

一般的に、指向性進化は、タンパク質変異体ライブラリの生成と、改善された特性を持つ変異体を選択するためのハイスループットスクリーニングプロセスを含む反復的な2段階プロセスとして要約できます。この技術では、タンパク質の構造と機能の関係に関する事前の知識は必要ありません。指向性進化は、ランダムまたは集中的な突然変異誘発を利用して、変異タンパク質のライブラリを生成します。ランダム突然変異は、エラープローンPCRまたはサイト飽和突然変異誘発のいずれかを使用して導入できます。変異体は、複数の相同遺伝子の組み換えを使用して生成することもできます。自然は限られた数の有益な配列を進化させてきました。指向性進化により、新しい機能を持つ未発見のタンパク質配列を特定できます。この能力は、タンパク質が折り畳みや安定性を損なうことなくアミノ酸残基の置換​​を許容する能力に依存します。^{[5] [ページが必要]}

指向性進化法は、無性生殖法と有性生殖法という 2 つの戦略に大別できます。

無性生殖法では、親遺伝子間のクロスリンクは生成されません。単一の遺伝子を使用して、さまざまな突然変異誘発技術を使用して突然変異体ライブラリを作成します。これらの無性生殖法では、ランダムまたは集中的な突然変異を生成できます。

ランダム突然変異誘発法は、対象の遺伝子全体にランダムに突然変異を生じさせます。ランダム突然変異誘発では、遷移、転座、挿入、欠失、反転、ミスセンス、ナンセンスなどの突然変異を誘発できます。ランダム突然変異誘発法の例を以下に示します。

エラーを起こしやすいPCRは、Taq DNAポリメラーゼが3'から5'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているという事実を利用しています。この結果、複製あたりヌクレオチドあたり0.001～0.002%のエラー率となります。この方法は、変異させたい遺伝子、または遺伝子内の領域を選択することから始まります。次に、生成したい活動の種類と程度に基づいて、必要なエラーの範囲を計算します。このエラーの範囲によって、使用するエラーを起こしやすいPCR戦略が決まります。PCRの後、遺伝子はプラスミドにクローン化され、コンピテント細胞システムに導入されます。次に、これらの細胞を目的の形質についてスクリーニングします。次に、プラスミドから改善された形質を示すコロニーを分離し、次の変異誘発のテンプレートとして使用します。エラーを起こしやすいPCRは、他の変異と比較して、特定の変異に偏りを示します。たとえば、転座よりも遷移に偏りがあります。^{[5] [ページが必要]}

PCRにおけるエラー率は、以下の方法で増加する可能性がある。^{[5] [ページが必要]}

1. 非相補的塩基対を安定化させる塩化マグネシウムの濃度を高めます。
2. 塩基対特異性を低下させるには塩化マンガンを加えます。
3. dNTP の追加の増加と不均衡。
4. dITP、8 oxo-dGTP、dPTP などの塩基類似体の追加。
5. Taqポリメラーゼの濃度を高めます。
6. 延長時間を延長します。
7. サイクルタイムを増やします。
8. 精度の低い Taq ポリメラーゼを使用します。

詳細については、 ポリメラーゼ連鎖反応も参照してください。

この PCR 法は、細菌が環状 DNA を増幅するために使用する方法をモデルにしたローリング サークル増幅に基づいています。この方法では、線状 DNA 二重鎖が生成されます。これらの断片には、コンカタマーと呼ばれる環状 DNA のタンデム リピートが含まれており、細菌株に形質転換することができます。変異は、まずターゲット シーケンスを適切なプラスミドにクローニングすることによって導入されます。次に、エラーが発生しやすいローリング サークル増幅条件下で、ランダム ヘキサマー プライマーと Φ29 DNA ポリメラーゼを使用して増幅プロセスが開始されます。エラーが発生しやすいローリング サークル増幅を生成するための追加条件は、テンプレート DNA 1.5 pM、MnCl ₂ 1.5 mM、および 24 時間の反応時間です。MnCl ₂を反応混合物に加えると、DNA 鎖のランダムな点変異が促進されます。変異率は、MnCl ₂の濃度を上げるか、テンプレート DNA の濃度を下げることで増加できます。エラーが発生しやすいローリング サークル増幅は、特定のプライマーではなくユニバーサル ランダム ヘキサマー プライマーを使用するため、エラーが発生しやすい PCR に比べて有利です。また、この増幅反応の生成物はリガーゼやエンドヌクレアーゼで処理する必要がない。この反応は等温である。^{[5] [ページが必要]}

化学的変異誘発では、化学物質を使用して遺伝子配列に変異を導入します。化学的変異原の例を以下に示します。

亜硫酸ナトリウムは、G/Cに富むゲノム配列の変異に効果的です。これは、亜硫酸ナトリウムがメチル化されていないシトシンをウラシルに脱アミノ化する触媒作用を持つためです。^{[5] [ページが必要]}

エチルメタンスルホン酸はグアニジン残基をアルキル化する。この変化はDNA複製中にエラーを引き起こす。^{[5] [ページが必要]}

亜硝酸はアデニンとシトシンの脱アミノ化によって転座を引き起こす。^{[5] [ページが必要]}

ランダム化学変異誘発への二重アプローチは、反復的な 2 段階のプロセスです。まず、EMS を介して対象遺伝子の生体内化学変異誘発を行います。次に、処理された遺伝子を分離し、未処理の発現ベクターにクローニングして、プラスミド バックボーンの変異を防止します。 ^{[5] [ページが必要]}この技術は、プラスミドの遺伝的特性を保存します。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、酵母における標的生体内突然変異誘発に使用されています 。この方法では、3-メチルアデニン DNA グリコシラーゼを tetR DNA 結合ドメインに融合します。これにより、ゲノムの tetO サイトを含む領域で突然変異率が 800 倍以上増加することが示されています。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、任意の長さの塩基の塊を同時に削除および挿入することにより、配列の長さを変更します。この方法は、新しい制限部位、特定のコドン、非天然アミノ酸用の4つの塩基コドンの導入により、新しい機能を備えたタンパク質を生成することが示されています。^{[5] [ページが必要]}

最近、トランスポゾンに基づくランダム突然変異誘発の多くの方法が報告されています。これらの方法には、PERMUTE ランダム円順列置換、ランダムタンパク質切断、ランダムヌクレオチドトリプレット置換、ランダムドメイン/タグ/複数アミノ酸挿入、コドンスキャン突然変異誘発、およびマルチコドンスキャン突然変異誘発が含まれますが、これらに限定されません。これらの前述の技術はすべて、ミニ Mu トランスポゾンの設計を必要とします。サーモサイエンティフィックは、これらのトランスポゾンの設計用キットを製造しています。^{[5] [ページが必要]}

これらの方法は、挿入および欠失変異によって遺伝子の長さを変更する。例としては、タンデムリピート挿入（TRINS）法がある。この技術は、ローリングサークル増幅によって標的遺伝子のランダムな断片のタンデムリピートを生成し、同時にこれらのリピートを標的遺伝子に組み込む。^{[5] [ページが必要]}

ミューテーター株は、1 つ以上の DNA 修復機構が欠損している細菌細胞株です。ミューテーター株の例としては、大腸菌 XL1-RED があります。^{[5] [ページが必要]}この大腸菌の従属株は、MutS、MutD、MutT DNA 修復経路が欠損しています。ミューテーター株の使用は、多くの種類の突然変異を導入するのに有効ですが、これらの株は、株自身のゲノムに突然変異が蓄積するため、培養すると進行性の病気を示します。^{[5] [ページが必要]}

集中変異誘発法は、あらかじめ決められたアミノ酸残基に変異を生じさせる。これらの技術には、対象となるタンパク質の配列と機能の関係を理解することが必要である。この関係を理解することで、安定性、立体選択性、触媒効率に重要な残基を特定することができる。^{[5] [ページが必要]}集中変異誘発法の例を以下に示す。

部位飽和変異誘発は、タンパク質の機能に重要な役割を果たすアミノ酸をターゲットにするために使用される PCR ベースの方法です。これを実行するための最も一般的な 2 つの手法は、全プラスミド単一 PCR とオーバーラップ拡張 PCR です。

全プラスミドシングルPCRは、部位特異的変異誘発（SDM）とも呼ばれます。SDM産物はDpnエンドヌクレアーゼ消化にかけられます。この消化により、親鎖のみが切断されます。親鎖にはアデニンのN6でメチル化されたGmATCが含まれているためです。SDMは、10キロベースを超える大きなプラスミドには適していません。また、この方法では、一度に2つのヌクレオチドしか置換できません。^{[5] [ページが必要]}

オーバーラップ伸長PCRでは、2組のプライマーを使用する必要があります。各セットの1つのプライマーには変異が含まれています。これらのプライマーセットを使用したPCRの1回目のラウンドが実行され、2つの二本鎖DNA二重鎖が形成されます。次に、PCRの2回目のラウンドが実行され、これらの二重鎖が変性され、プライマーセットで再びアニールされて、各鎖に変異があるヘテロ二重鎖が生成されます。これらの新しく形成されたヘテロ二重鎖のギャップはDNAポリメラーゼで埋められ、さらに増幅されます。^{[5] [ページが必要]}

配列飽和突然変異は、標的配列のあらゆるヌクレオチド位置のランダム化をもたらす。この方法は、3'末端のテンプレートトランスフェラーゼを使用して、ユニバーサル塩基で終端された可変長DNA断片の生成から始まる。次に、これらの断片は一本鎖テンプレートを使用して全長まで延長される。ユニバーサル塩基はランダムな標準塩基に置き換えられ、突然変異を引き起こす。この方法には、SeSAM-Tv-II、SeSAM-Tv+、SeSAM-IIIなど、いくつかの修正版がある。^{[5] [ページが必要]}

この部位飽和変異法には、2つの別々のPCR反応が含まれます。最初の反応ではフォワードプライマーのみを使用し、2番目の反応ではリバースプライマーのみを使用します。これにより、プライマーダイマーの形成が回避されます。^{[5] [ページが必要]}

この部位飽和変異誘発法は、1つの変異誘発オリゴヌクレオチドと1つのユニバーサルフランキングプライマーから始まります。これら2つの反応物は、最初のPCRサイクルに使用されます。この最初のPCRサイクルからの産物は、次のPCRのメガプライマーとして使用されます。^{[5] [ページが必要]}

この部位飽和変異誘発法は、オーバーラップ伸長PCRに基づいています。これは、環状プラスミドの任意の部位に変異を導入するために使用されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、単一または複数のサイトで同時にユーザー定義のサイト指向性突然変異誘発を利用します。OSCARR は、カセットのランダム化と組み換えのためのワンポットシンプルメソッドの略語です。このランダム化と組み換えにより、タンパク質の目的のフラグメントがランダム化されます。Omnichange は、シーケンスに依存しないマルチサイト飽和突然変異誘発で、遺伝子の最大 5 つの独立したコドンを飽和させることができます。

この方法では、冗長なコドンと終止コドンが削除されます。

これはPCRベースの方法です。カセット突然変異誘発は、両側に制限部位が隣接する、目的の遺伝子を含むDNAカセットの合成から始まります。これらの制限部位を切断するエンドヌクレアーゼは、ターゲットプラスミド内の部位も切断します。DNAカセットとターゲットプラスミドの両方をエンドヌクレアーゼで処理して、これらの制限部位を切断し、粘着末端を作成します。次に、この切断産物を一緒に連結し、遺伝子をターゲットプラスミドに挿入します。カセット突然変異誘発の別の形式であるコンビナトリアルカセット突然変異誘発は、目的のタンパク質内の個々のアミノ酸残基の機能を識別するために使用されます。次に、再帰的アンサンブル突然変異誘発は、以前のコンビナトリアルカセット突然変異誘発からの情報を活用します。コドンカセット突然変異誘発では、二本鎖DNAの特定の部位に1つのコドンを挿入または置換できます。^{[5] [ページが必要]}

有性的な指向性進化の方法には、生体内での自然な組み換えを模倣した試験管内組み換えが含まれる。一般的に、これらの技術には親遺伝子間の高い配列相同性が必要である。これらの技術は、2つの異なる親遺伝子の組み換えによく使用され、これらの遺伝子間の交差が生じる。^{[5] [ページが必要]}

相同組換えは、生体内または試験管内のいずれかに分類できます。試験管内相同組換えは、生体内の自然な組換えを模倣します。これらの試験管内組換え法では、親の配列間の高い配列相同性が必要です。これらの技術は、親の遺伝子を組み換えてキメラ遺伝子を生成することで、親の遺伝子の自然な多様性を活用します。結果として得られるキメラは、親の特性の混合を示します。^{[5] [ページが必要]}

この試験管内技術は、組み換えの時代における最初の技術の 1 つでした。これは、相同親遺伝子を DNase1 で小さな断片に分解することから始まります。これらの小さな断片は、消化されていない親遺伝子から精製されます。精製された断片は、プライマーレス PCR を使用して再構成されます。この PCR では、異なる親遺伝子からの相同断片が互いにプライミングし、キメラ DNA が生成されます。親サイズのキメラ DNA は、通常の PCR で末端プライマーを使用して増幅されます。^{[5] [ページが必要]}

このin vitro相同組換え法は、ランダム配列プライマーを使用して、点突然変異を示す多数の短い遺伝子断片の合成から始まります。これらの断片は、プライマーレス PCR を使用して全長の親遺伝子に再構成されます。次に、再構成された配列は PCR を使用して増幅され、さらに選択プロセスにかけられます。この方法は、DNase1 を使用しないため、ピリミジンヌクレオチドの隣で組換えが起こる偏りがなく、DNA シャッフリングに比べて有利です。また、この方法は、長さが均一で偏りのない合成ランダムプライマーを使用するという利点もあります。最後に、この方法は DNA テンプレート配列の長さに依存せず、少量の親 DNA を必要とします。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、メタゲノムサンプルから直接キメラ遺伝子を生成します。メタゲノム DNA サンプルから機能スクリーニングによって目的の遺伝子を分離することから始まります。次に、特定のプライマーを設計し、それを使用してさまざまな環境サンプルから相同遺伝子を増幅します。最後に、増幅された相同遺伝子をシャッフルして、目的の機能クローンを取得するためのキメラライブラリを生成します。^{[5] [ページが必要]}

このin vitro法は、テンプレートの切り替えに基づいてキメラ遺伝子を生成する。この PCR ベースの方法は、テンプレートの初期変性から始まり、プライマーのアニーリングと短い伸長時間が続く。その後のすべてのサイクルでは、前のサイクルで生成された短い断片とテンプレートのさまざまな部分との間でアニーリングが発生する。これらの短い断片とテンプレートは、配列の相補性に基づいてアニーリングする。断片がテンプレート DNA をアニーリングするこのプロセスは、テンプレートの切り替えとして知られている。これらのアニーリングされた断片は、その後の伸長のためのプライマーとして役立つ。この方法は、親の長さのキメラ遺伝子配列が得られるまで実行される。この方法の実行には、開始するためにフランキングプライマーのみが必要である。Dnase1 酵素も必要ではない。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、キメラ遺伝子あたり平均 14 回の交差を伴うキメラ遺伝子ライブラリを生成することが示されています。親遺伝子の上部鎖からの断片を相同遺伝子のウラシルを含むテンプレートの下部鎖に整列させることから開始します。5' および 3' オーバーハング フラップが切断され、ギャップは Pfu および taq DNA ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性によって埋められます。次に、ウラシルを含むテンプレートは、ウラシル DNA グリコシラーゼで処理してヘテロ二重鎖から除去され、その後 PCR を使用してさらに増幅されます。この方法は、交差頻度が比較的高いキメラを生成するという利点があります。ただし、複雑さと、一本鎖 DNA およびウラシルを含む一本鎖テンプレート DNA を生成する必要があるため、ある程度制限があります。^{[5] [ページが必要]}

合成縮重オリゴヌクレオチドのシャッフルは、最適なコドンと有益な変異を含むオリゴヌクレオチドを含めることができるため、シャッフル方法に柔軟性を追加します。^{[5] [ページが必要]}

酵母で行われるクローニングは、断片化された発現ベクターのPCR依存的な再構成を伴う。再構成されたベクターはその後、酵母に導入され、クローン化される。酵母を使用してベクターをクローン化することで、大腸菌でのライゲーションと増殖によって導入される毒性と逆選択を回避できる。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、酵母における相同組換えの高頻度を利用して、遺伝子の特定の領域に変異を導入し、他の部分はそのまま残します。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、進化する遺伝子を宿主から宿主へ移送するために、改変されたライフサイクルを持つバクテリオファージを利用する。ファージのライフサイクルは、移送が酵素の目的の活性と相関するように設計されている。この方法は、遺伝子の継続的な進化のために人間の介入が最小限で済むという利点がある。^[5]

これらの方法は、タンパク質は配列相同性がなくても類似の構造的同一性を示す可能性があるという事実に基づいています。

エクソンシャッフルとは、イントロンで起こる組み換えイベントによって、異なるタンパク質のエクソンを組み合わせることである。オーソログエクソンシャッフルでは、異なる種のオーソログ遺伝子のエクソンを組み合わせる。オーソログドメインシャッフルでは、異なる種のオーソログ遺伝子のタンパク質ドメイン全体をシャッフルする。パラログエクソンシャッフルでは、同じ種の異なる遺伝子のエクソンをシャッフルする。パラログドメインシャッフルでは、同じ種のパラログタンパク質のタンパク質ドメイン全体をシャッフルする。機能的ホモログシャッフルでは、機能的に関連する非相同ドメインをシャッフルする。これらのプロセスはすべて、キメラ合成オリゴヌクレオチドを使用して、異なる遺伝子から目的のエクソンを増幅する。この増幅産物は、プライマーレスPCRを使用して全長遺伝子に再構成される。これらのPCRサイクル中、断片はテンプレートおよびプライマーとして機能する。その結果、キメラ全長遺伝子が生成され、スクリーニングにかけられる。^{[5] [ページが必要]}

親遺伝子の断片は、エキソヌクレアーゼ III による制御された消化を使用して作成されます。これらの断片はエンドヌクレアーゼを使用して平滑化され、連結されてハイブリッド遺伝子が生成されます。THIOITCHY は、α-ホスホチオエート dNTP などのヌクレオチド三リン酸類似体を利用する改良型 ITCHY 技術です。これらのヌクレオチドを組み込むと、エキソヌクレアーゼ III による消化がブロックされます。このエキソヌクレアーゼ III による消化の阻害はスパイキングと呼ばれます。スパイキングは、まずエキソヌクレアーゼで遺伝子を切り詰めて、短い一本鎖オーバーハングを持つ断片を作成することによって実現できます。次に、これらの断片は、少量のホスホチオエート dNTP の存在下で DNA ポリメラーゼによる増幅のテンプレートとして機能します。次に、これらの結果として得られた断片を連結して、完全長の遺伝子を形成します。あるいは、無傷の親遺伝子を、通常の dNTP とホスホチオエート dNTP の存在下で PCR によって増幅することもできます。これらの全長増幅産物は、その後エキソヌクレアーゼによる消化を受ける。エキソヌクレアーゼがα-pdNTPに遭遇するまで消化は続き、異なる長さの断片が生じる。これらの断片は連結されてキメラ遺伝子が生成される。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、DNAシャッフルとITCHYを組み合わせることで、多重交差を阻害するハイブリッド遺伝子のライブラリを生成します。この方法は、2つの独立したITCHYライブラリの構築から始まります。1つはN末端に遺伝子Aを持ち、もう1つはN末端に遺伝子Bを持ちます。これらのハイブリッド遺伝子断片は、制限酵素消化または末端プライマーを使用したPCRとアガロースゲル電気泳動によって分離されます。次に、これらの分離された断片を混合し、DNase1を使用してさらに消化します。消化された断片は、テンプレートスイッチングによるプライマーレスPCRによって再構築されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、キメラのテンプレートとして一本鎖 DNA 断片が存在する状態で、一方向に成長するポリヌクレオチドのテンプレート スイッチングによってハイブリッド遺伝子のライブラリを生成します。この方法は、ターゲット mRNA からの逆転写によって一本鎖 DNA 断片を準備することから始まります。次に、遺伝子特異的プライマーが一本鎖 DNA にアニールされます。これらの遺伝子は、PCR サイクル中に延長されます。このサイクルの後には、テンプレート スイッチングと、以前のプライマー延長から得られた短い断片の他の一本鎖 DNA 断片へのアニールが続きます。このプロセスは、全長の一本鎖 DNA が得られるまで繰り返されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法では、配列相同性がほとんどまたは全くない遺伝子間の組み換えが行われます。これらのキメラは、いくつかの制限部位を含むリンカー配列を介して融合されます。次に、このコンストラクトは DNase1 を使用して消化されます。作成された断片は、S1 ヌクレアーゼを使用して平滑末端化されます。これらの平滑末端断片は、ライゲーションによって環状配列にまとめられます。次に、この環状コンストラクトは、制限部位がリンカー領域に存在する制限酵素を使用して直線化されます。これにより、開始コンストラクトと比較して、5' 末端と 3' 末端への遺伝子の寄与が逆転したキメラ遺伝子のライブラリが作成されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法により、複数の親遺伝子から複数の交差を持つ遺伝子のライブラリが作られる。この方法では、親遺伝子間の配列の同一性は必要ない。ただし、交差位置ごとに 1 つまたは 2 つの保存されたアミノ酸が必要である。親配列のアラインメントと交差部位として機能するコンセンサス領域の特定から始まる。次に、制限部位を含む特定のタグを組み込み、Bac1 による消化でタグを除去して、付着末端を持つ遺伝子を作成する。これらの遺伝子断片を適切な順序で混合して連結し、キメラ ライブラリを形成する。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、相同遺伝子のアラインメントから始まり、多型領域の特定が続きます。次に、遺伝子の上部鎖が小さな縮重オリゴヌクレオチドに分割されます。下部鎖もオリゴヌクレオチドに分解され、足場として機能します。これらの断片は溶液中で結合され、上部鎖オリゴヌクレオチドが下部鎖オリゴヌクレオチド上に組み立てられます。これらの断片間のギャップはポリメラーゼで埋められ、連結されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法では、相同性のない複数のDNA断片を1回のPCRでシャッフルします。これにより、異なる構造単位をコードするモジュールを組み立てることで完全なタンパク質が再構築されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、ウラシル dNTP を使用して、組み換えが必要な遺伝子断片を増幅することから始まります。この増幅溶液には、プライマー、PfuTurbo、Cx Hotstart DNA ポリメラーゼも含まれています。次に、増幅された産物を USER 酵素でインキュベートします。この酵素は、DNA からウラシル残基を除去し、1 塩基対のギャップを作成する触媒作用をします。USER 酵素で処理された断片は、T4 DNA リガーゼを使用して混合および連結され、テンプレート DNA を除去するために Dpn1 消化にかけられます。結果として得られた 2 本鎖断片は、PCR を使用して増幅され、大腸菌に形質転換されます。^{[5] [ページが必要]}

この方法では、制限部位の外側を切断するタイプ 2 制限酵素を使用して、アクセプター ベクター内の少なくとも 9 つの異なるフラグメントを組み換えることができます。これは、両側に Bsa1 隣接配列を作成するために、別々のベクターでフラグメントをサブクローニングすることから始まります。次に、これらのベクターはタイプ II 制限酵素 Bsa1 を使用して切断され、4 つのヌクレオチドの一本鎖オーバーハングが生成されます。相補的なオーバーハングを持つフラグメントは、T4 DNA リガーゼを使用してハイブリダイズされ、連結されます。最後に、これらの構築物は大腸菌細胞に形質転換され、発現レベルについてスクリーニングされます。^{[5] [ページが必要]}

この方法は、構造要素またはタンパク質ドメイン全体を組み換えるために使用できます。この方法は、ホスホロチオジエステル結合の特定の切断を可能にするホスホロチオエート化学に基づいています。プロセスの最初のステップは、ベクターバックボーンと一緒に組み換える必要があるフラグメントの増幅から始まります。この増幅は、5' 末端にホスホロチオレート化ヌクレオチドを持つプライマーを使用して行われます。増幅された PCR 産物は、高温のエタノールヨウ素溶液で切断されます。次に、これらのフラグメントは室温でハイブリダイズされ、傷を修復する大腸菌に形質転換されます。^{[5] [ページが必要]}

このシステムは、大腸菌の自然な部位特異的組換えシステムに基づいています。このシステムはインテグロンシステムと呼ばれ、自然な遺伝子シャッフリングを生み出します。この方法は、インテグロンシステムを使用して、個々の組換えカセットまたはtrpA-E遺伝子を調節要素とともに送達することにより、trp欠損大腸菌で機能的なトリプトファン生合成オペロンを構築および最適化するために使用されました。^{[5] [ページが必要]}

この方法では、5' または 3' 末端の 1 つのブロック配列、ステム ループ領域の相補配列、および PCR のプライマー結合部位として機能する D 分岐領域を含む 1 本鎖 DNA 鎖が生成されます。5' および 3' ハーフ ストランドの両方を等量混合し、ステム領域の相補性によりハイブリッドを形成します。次に、3' ハーフ ストランドの遊離リン酸化 5' 末端を持つハイブリッドを、0.1 mM ATP の存在下で T4 DNA リガーゼを使用して 5' ハーフ ストランドの遊離 3' 末端と連結します。次に、連結された産物を 2 種類の PCR で増幅して、プレ 5' ハーフおよびプレ 3' ハーフ PCR 産物を生成します。これらの PCR 産物は、ビオチン標識されたステム配列を含むプライムの 5' 末端にアビジン-ビオチンが結合することで、1 本鎖に変換されます。次に、ビオチン化された5'ハーフストランドと非ビオチン化3'ハーフストランドが、次のYライゲーションサイクルの5'ハーフストランドと3'ハーフストランドとして使用されます。^{[5] [ページが必要]}

半合理的設計では、タンパク質の配列、構造、機能に関する情報を予測アルゴリズムと組み合わせて使用​​します。これらを組み合わせて、タンパク質の機能に最も影響を与える可能性のある標的アミノ酸残基を特定します。これらの重要なアミノ酸残基の変異により、特性が強化される可能性が高い変異タンパク質のライブラリが作成されます。^[11]

半合理的酵素工学と de novo 酵素設計の進歩は、研究者に生体触媒を操作するための強力で効果的な新しい戦略を提供します。ライブラリ設計における配列と構造に基づくアプローチの統合は、酵素の再設計の優れたガイドであることが証明されています。一般的に、現在の計算による de novo および再設計方法は、触媒性能において進化した変異体とは比較になりません。指向性進化を使用して実験的最適化を実現できるかもしれませんが、構造予測の精度のさらなる向上と触媒能力の向上は、設計アルゴリズムの改善によって達成されます。タンパク質ダイナミクスを統合することで、将来のシミュレーションにさらなる機能強化が含まれる可能性があります。^[11]

生化学的および生物物理学的研究と予測フレームワークの微調整は、個々の設計機能の機能的意義を実験的に評価するのに役立ちます。これらの機能的貢献をよりよく理解することで、将来の設計を改善するためのフィードバックが得られます。^[11]

タンパク質工学における選択方法として、指向性進化が置き換えられることはおそらくないだろうが、計算によるタンパク質設計は、タンパク質工学が生体高分子を操作する方法を根本的に変えてきた。仮説主導型タンパク質工学の予測フレームワークを組み込んだ方法を使用することで、より小さく、より焦点を絞った、機能的に豊富なライブラリを生成できるかもしれない。新しい設計戦略と技術の進歩は、従来のプロトコルからの脱却を始めている。例えば、指向性進化は、焦点を絞ったライブラリで最も優れた候補を特定するための最も効果的な戦略である。全遺伝子ライブラリ合成は、ライブラリの準備のためのシャッフルおよび突然変異誘発プロトコルに取って代わっている。また、非常に特異的な低スループットスクリーニングアッセイは、何百万もの候補の膨大なスクリーニングおよび選択作業の代わりにますます適用されるようになっている。これらの開発が相まって、タンパク質工学は指向性進化を超えて、バイオ触媒をカスタマイズするための実用的でより効率的な戦略へと向かう準備ができている。^[11]

タンパク質が指向性進化、配給設計、または半配給設計を経ると、変異タンパク質のライブラリをスクリーニングして、どの変異体が強化された特性を示すかを判断する必要があります。ファージディスプレイ法は、タンパク質をスクリーニングするための 1 つの方法です。この方法では、変異ポリペプチドをコードする遺伝子とファージコートタンパク質遺伝子を融合します。ファージ表面に発現したタンパク質変異体は、in vitro で固定化されたターゲットと結合することによって選択されます。選択されたタンパク質変異体を持つファージは、細菌内で増幅され、酵素結合免疫吸着法によって陽性クローンが識別されます。選択されたファージは、DNA 配列決定にかけられます。^{[5] [ページが必要]}

細胞表面ディスプレイシステムは、変異ポリペプチドライブラリのスクリーニングにも利用できます。ライブラリの変異遺伝子は発現ベクターに組み込まれ、適切な宿主細胞に形質転換されます。これらの宿主細胞は、さらにハイスループットスクリーニング法にかけられ、目的の表現型を持つ細胞が特定されます。^{[5] [ページが必要]}

無細胞ディスプレイシステムは、 in vitroタンパク質翻訳または無細胞翻訳を利用するために開発されてきた。これらの方法には、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合および非共有結合DNAディスプレイ、およびin vitro区画化が含まれる。^{[5] ：53}

酵素工学は、酵素の構造（および機能）を変更したり、単離された酵素の触媒活性を変更して、新しい代謝物を生成したり、反応を起こすための新しい（触媒された）経路を可能にしたり、^[12]特定の化合物を他の化合物に変換したり（生体内変換）する応用です。これらの製品は、化学物質、医薬品、燃料、食品、または農業添加物として有用です。

酵素反応器 [ ^13]は、酵素による目的の変換を行うために使用される反応媒体を含む容器で構成されています。このプロセスで使用される酵素は溶液中に遊離しています。また、微生物は本物の酵素の重要な起源の1つです。^[14]

コンピューティング手法は、 Top7 ^[15]や非天然分子のセンサーなどの新しい折り畳み構造を持つタンパク質の設計に使用されています。 ^[16]融合タンパク質のエンジニアリングにより、クリオピリン関連周期性症候群の治療薬として米国食品医薬品局（FDA）の承認を取得した医薬品、リロナセプトが誕生しました。

別の計算方法であるIPROは、カンジダ・ボイディニキシロース還元 酵素の補因子特異​​性の切り替えをうまく設計しました。 ^{[17]反復タンパク質再設計および最適化（IPRO）は、天然または新規の}基質および補因子に対する特異性を高めたり、特異性を与えたりするためにタンパク質を再設計します。これは、指定された設計位置の周りのタンパク質の構造を繰り返しランダムに摂動させ、回転異性体の最も低いエネルギーの組み合わせを特定し、新しい設計が以前のものよりも結合エネルギーが低いかどうかを判断することによって行われます。^[18]

計算支援設計は、高度に秩序だったナノタンパク質アセンブリの複雑な特性を設計するためにも使用されている。^[19] 2つのオリゴマー化状態を占めることによって構造不安定性と不完全な自己組織化挙動を自然に示しているタンパク質ケージである大腸菌バクテリオフェリチン（EcBfr）が、この研究のモデルタンパク質である。計算分析とその相同体との比較を通じて、このタンパク質は、主に2つの水架橋アスパラギン残基を中心とした界面水ポケットの存在により、2回対称軸上の二量体界面が平均よりも小さいことがわかった。EcBfrを改変した構造安定性の設計の可能性を調査するために、半経験的計算方法を使用して、野生型EcBfrと比較した二量体界面での480の可能な変異体のエネルギー差を仮想的に調査した。この計算研究は、水架橋アスパラギンにも収束している。これら2つのアスパラギンを疎水性アミノ酸に置き換えると、円二色性および透過型電子顕微鏡で証明されているように、 αヘリックスモノマーに折り畳まれてケージに組み立てられるタンパク質が得られます。熱変性と化学変性の両方で、再設計されたすべてのタンパク質が計算と一致して安定性が向上していることが確認されています。3つの変異のうちの1つは、サイズ排除クロマトグラフィーとネイティブゲル電気泳動の両方で示されているように、溶液中の高次オリゴマー化状態に有利​​なように集団をシフトさせます。^[19]

細菌チャネルタンパク質（OmpF）を再設計して、1nmの細孔サイズを任意のサブnmサイズに縮小するために、 in silico法であるPoreDesigner ^[20]が開発されました。設計された最も狭い細孔での輸送実験では、生体模倣ブロックポリマーマトリックスに組み立てると、塩が完全に除去されることが明らかになりました。

• WHAT IFソフトウェアに基づくタンパク質工学および関連トピック用のサーバー
• ゼロから構築された酵素 - 研究者は新しい計算技術を使用して、これまでに見たことのない触媒を設計します、テクノロジーレビュー、2008 年 3 月 10 日