部位特異的リコンビナーゼ技術

部位特異的リコンビナーゼ技術は、リコンビナーゼ酵素を利用してDNA の標的部分を置き換える ゲノムエンジニアリングツールです。

1980 年代後半、マウス胚性幹細胞(ESC) における遺伝子ターゲティングにより、マウス生殖細胞への突然変異の伝達が可能になり、ゲノムに存在する制御ネットワークの遺伝的基礎を研究するための新しい選択肢として登場しました。しかし、従来の遺伝子ターゲティングは、組み換え ESC を選択するために導入する必要があったマーカー遺伝子によって遺伝子機能が不可逆的に破壊されたため、いくつかの点で限界があることが判明しました。これらの初期段階では、動物の体のすべての細胞に最初から突然変異が存在し、複雑な表現型や早期の死亡につながりました。これらの突然変異を特定の発達段階と特定の細胞タイプに限定する方法が明らかに必要でした。この夢は、米国のグループがバクテリオファージと酵母由来の部位特異的組み換え (SSR-) システムをマウスだけでなく哺乳類細胞にも導入できたときに実現しました。^{[1] [2] [3]}

一般的な遺伝子工学戦略では、標的ゲノムの恒久的な改変が必要です。このため、トランスジーンの送達に適用される経路の設計に多大な精巧さを投入する必要があります。バイオテクノロジーの目的ではランダムな組み込みが依然として一般的ですが、トランスジーンのコピー数が変動したり、組み込み部位が制御されなかったり、関連する突然変異が発生したりするため、予測できない遺伝子発現が生じる可能性があります。幹細胞分野の分子要件ははるかに厳格です。ここでは、相同組換え(HR) は、原理的には組み込みプロセスに特異性を与えることができますが、真核生物の場合、その効率は極めて低いという欠点があります。メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (ZFN および TALEN) は HR をサポートする実際のツールですが、予測可能な特性を持つ細胞株の合理的な構築のきっかけとなったのは、部位特異的リコンビナーゼ (SSR) の利用でした。現在では、HRとSSRの両方の技術を、非常に効率的な「タグアンド交換技術」に組み合わせることができます。^[4]

さまざまな目的でこれらのDNA再編成を実行するために多くの部位特異的組換えシステムが特定されていますが、これらのほとんどは、そのメカニズムに応じて、チロシンリコンビナーゼ（YR）とセリンリコンビナーゼ（SR）の2つのファミリーのいずれかに属します。これら2つのファミリーは、その起源と構造に基づいて、異なる反応経路に沿って最大3種類のDNA再編成（統合、切除/解決、および反転）を媒介できます。^[5]

YR ファミリーの創始メンバーは、バクテリオファージ λによってコード化され、ファージ DNA を細菌ゲノムに統合できるようにするラムダ インテグラーゼです。このクラスの共通点は、切断可能な DNA リン酸を攻撃して 3'-ホスホチロシン結合を形成する保存されたチロシン求核剤です。SR ファミリーの初期メンバーは、細菌トランスポゾン Tn3 および γδ 由来の密接に関連したリゾルバーゼ / DNA インベルターゼで、切断可能なリン酸を攻撃して 5'-ホスホセリン結合を形成する触媒セリンに依存しています。しかし、これらの議論の余地のない事実は、他のメンバーが登場したときにかなりの混乱によって損なわれました。たとえば、YR リコンビナーゼCreおよびFlp (統合、切除/解決、反転が可能) は、それでも「インテグラーゼ ファミリー」の新しいメンバーとして歓迎されました。逆の例としては、PhiC31 および関連する SR があります。これらはもともとリゾルバーゼ/インベルターゼとして導入されましたが、補助因子がない場合、統合が唯一の機能です。現在では、各酵素の標準的な活性によって分類が決定され、INT、RES、INV の 3 つの経路すべてを含むファミリー メンバーには、一般的な用語「リコンビナーゼ」が使用されています。

この表は、従来の SSR システムの選択範囲を拡張し、これらをその性能に応じてグループ分けしています。これらの酵素はすべて、同一 (サブファミリー A1) または異なる (A2、B1、B2 のファージ由来酵素) 2 つのターゲット サイトを組み換えます。^[6] A1 の場合、これらのサイトには個別の名称 ( Flp リコンビナーゼの場合は「 FRT 」、 Cre リコンビナーゼの場合はloxP ) がありますが、その他の場合は「 att P」および「att B」(それぞれファージ部分と細菌部分の結合サイト) という用語が有効です。サブファミリー A1 の場合、8 bp スペーサー (赤線の二重線で示される交差領域) を挟んだ 2 つの (ほぼ) 同一の 13 bp アーム (矢印) で構成される短い (通常 34 bp) サイトを処理する必要があります。^[7] Flp には、それぞれ Flp ユニット (いわゆる「プロトマー」) を収容する 3 つのアームを備えた 48 bp の代替サイトがあることに留意してください。att P サイトとatt B サイトは同様の構造ルールに従いますが、ここではアームは部分的な同一性しか示さず (破線で示されています)、両方のケースで異なります。これらの特徴が関連する違いを説明します。

• 2 つの同一の抽出物部位の組み換えにより、両方の基質からのアームを含むが同じ構成の生成物部位が生成されます。これらの変換は可逆的です。
• att P x att B の組み換えの場合、交差はこれらの補完的なパートナー間でのみ発生し、不可逆的な方法で 2 つの異なる生成物 ( att P x att B → att R + att L) が生成されます。

この章を簡潔にするため、以下の実装では、2 つのリコンビナーゼ (Flp と Cre) と 1 つのインテグラーゼ (PhiC31) に焦点を絞ります。これは、これらのスペクトルが、現在、主にゲノムの誘導修飾に使用されているツールをカバーしているためです。これは、以下の概要の枠組みの中で行われます。

統合/解決および反転モード（INT/RESおよびINV）は、これらのatt Pとatt Bのペア間のリコンビナーゼ標的部位（RTS）の方向に依存します。セクションCでは、リコンビナーゼ媒介カセット交換（RMCE）が同期二重相互交差（統合の後に解決するのではなく）によってどのように達成されるかを合理的に示しています。^{[8] [9]}

Tyr リコンビナーゼは可逆的ですが、Ser インテグラーゼは一方向性です。注目すべきは、可逆的な Flp (Tyr リコンビナーゼ) の統合/解決が 48 bp (最小 34 bp の代わりに) FRTバージョンによって調整される方法です。追加の 13 bp アームは、Flp-INT および Flp-RMCE 機能の両方のコンテキストで、シナプス複合体の形成に寄与する Flp「着陸パス」として機能します (それぞれの平衡状況を参照)。セクション A の統合の (エントロピー駆動による) 反転を Cre で防止することはほとんど不可能ですが、Flp で達成することは困難です。ただし、ドナー プラスミドが過剰に提供される場合、順方向および逆方向の反応の両方の二分子特性により、RMCE は完了できます。両方のFRTサイトを逆方向に配置することで、挿入の両方の方向の平衡が実現します (緑の矢印)。 Flpとは対照的に、SerインテグラーゼPhiC31（下の図）は、少なくともリコンビナーゼ方向性（RDF）因子がない場合には、一方向の統合をもたらします。^{[10] 2つの異なる（「異種特異的」）} FRTスペーサー変異体 を必要とするFlp-RMCEと比較して、最初の反応att Pサイトの反応パートナー（ att B）は任意にヒットするため、ドナーカセットがターゲットに入る方向は制御されません（代替製品を参照）。また、Flp-RMCEとは異なり、異種特異的（非交差相互作用） att P/ att B の組み合わせがないため、複数の異なるRMCEターゲットを並行してマウントすることはできません。

Creリコンビナーゼ（Cre）は、補因子を必要とせずに特定のDNA配列を組み換えることができます。この酵素は、 loxP （「ファージP1の交差部位」）と呼ばれる34塩基対のDNA配列を認識します 。標的部位の互いの方向に応じて、CreはDNA配列を統合/切除または反転します。特定のDNA領域の切除（環状基質の場合は「分解」と呼ばれる）により、正常な遺伝子発現が大幅に損なわれるか、終了する。^[11]

Cre の顕著な分解活性のため、その初期の用途の 1 つは、lox P に挟まれた (「floxed」) 遺伝子の切除であり、Cre が目的の組織で発現した後、そのような floxed 遺伝子の細胞特異的遺伝子ノックアウトにつながりました。現在の技術には、Cre 活性の空間的および時間的制御を可能にする方法が組み込まれています。遺伝子改変の空間的制御を容易にする一般的な方法は、 Cre 発現を駆動する組織特異的プロモーターの選択です。このようなプロモーターの制御下に Cre を配置すると、局所的な組織特異的発現がもたらされます。例として、Leone らは、転写ユニットをミエリンプロテオリピドタンパク質 (PLP) 遺伝子の調節配列の制御下に置き、オリゴデンドロサイトとシュワン細胞で標的遺伝子配列の誘導除去をもたらしました。^[12] Cre によって認識される特定の DNA 断片は、PLP 遺伝子を発現しない細胞ではそのまま残ります。これにより、中枢神経系（CNS）と末梢神経系（PNS）の神経線維を取り囲むミエリン鞘におけるゲノム変化の局所的影響を経験的に観察することが容易になります。^[13]選択的なCre発現は、他の多くの細胞タイプや組織でも達成されています。

切除反応の時間的活性を制御するために、さまざまなリガンド結合ドメインを利用するCreの形態が開発されている。特定の時間的Cre活性を誘導するための1つの成功した戦略は、酵素をヒトエストロゲン受容体（ERt）の変異リガンド結合ドメインと融合させることである。タモキシフェン（エストロゲン受容体拮抗薬）の導入により、Cre-ERt構築物は核に浸透し、標的変異を誘導することができる。ERtは内因性 エストロゲンよりも高い親和性でタモキシフェンに結合するため、タモキシフェンで処理していない動物ではCre-ERtが細胞質内に留まることができる。タモキシフェンによるSSR活性の時間的制御により、胚発生後期および/または成体組織で遺伝子変化を誘導することができる。^[12]これにより、研究者は標的遺伝子の機能を調査しながら胚致死を回避できる。

これらの一般的な概念の最近の拡張により、「Cre動物園」、つまり、特定の遺伝子を標的のCre発現によって削除できる数百のマウス系統のコレクションが生成されました。^[3]

Flp/ FRTシステムは、その自然宿主 (S. cerevisiae) において、同一だが反対方向のFRT部位 (「フリッパーゼ」活性) に挟まれたセグメントの反転によって「2μ プラスミド」の複製を可能にします。この反転により、プラスミド内の複製フォークの相対的な方向が変わり、「ローリング サークル」、つまり多量体中間体が分解されて複数の単量体生成物が放出される前に環状の 2μ エンティティが増幅されます。34 bp の最小FRT部位は、Cre の類似lox P 部位と同程度に切除/分解を促進しますが、自然でより拡張された 48 bp の FRT バリアントは、Cre- ^[5]や PhiC31などのファージ酵素で説明されている特定の無差別な相互作用を克服しながら、より高度な統合を可能にします。^{[6]さらなる利点は、単純なルールを適用して、同等のパートナーとは交差するが野生型}FRTとは交差しない異種特異的FRT部位を生成できることです。これらの事実により、1994年以降、標的カセットをドナーカセットときれいに交換することを可能にするリコンビナーゼ媒介カセット交換（RMCE）戦略の開発と継続的な改良が可能になりました。 ^[6]

RMCE 技術に基づき、EUCOMM (欧州条件付きマウス突然変異誘発) プログラムの枠組みの中で、さらなる精緻化に適した、特性評価済みの ES 株の特定のリソースが開発されました。このリソースは、現在確立されている Cre および/または Flp ベースの「FlExing」(Flp 介在切除/反転) セットアップ ( ^[6]切除および反転アクティビティを含む) に基づいています。2005 年に開始されたこのプロジェクトは、まず飽和突然変異誘発に焦点を当て、マウスゲノムの完全な機能注釈を可能にしました (国際ノックアウトマウスコンソーシアム (IKMC) が調整)。最終目標は、マウス ES 細胞で遺伝子トラッピングと遺伝子ターゲティングによってすべてのタンパク質遺伝子を変異させることです。^[14]これらの取り組みは、さまざまな「タグアンドエクスチェンジ」戦略の頂点を極めたもので、特定のゲノム部位にタグを付けることで、その「タグ」が新しい（または既存の）遺伝情報を導入するためのアドレスとして機能することを目指しています。タグ付けのステップ自体は、レトロウイルスやPhiC31のような部位特異的インテグラーゼの統合の好みを利用して、特定のクラスの統合部位に対処することができます。どちらも基本的に一方向に作用します。

従来の面倒な「タグ・アンド・エクスチェンジ」手順は、2 つの連続した相同組換え (HR-) ステップに依存しており、最初のステップ (「HR1」) では選択マーカー遺伝子からなるタグを導入します。次に、「HR2」を使用してマーカーを「GOI」に置き換えます。最初の (「ノックアウト」-) 反応では、遺伝子に選択マーカーがタグ付けされます。通常、これは G418 耐性を提供する hygtk ([+/-]) カセットの挿入によって行われます。次の「ノックイン」ステップでは、タグ付けされたゲノム配列が特定の変異を持つ相同ゲノム配列に置き換えられます。その後、HSV-tk 遺伝子の喪失によるガンシクロビル耐性 (「ネガティブ選択」) によって細胞クローンを分離できます。この従来の 2 段階のタグ・アンド・エクスチェンジ手順^[15] は、RMCE の登場により合理化され、ノックイン ステップを引き継いで効率を高めることができます。

疑いの余地なく、Serインテグラーゼは、トランスジーンを、よく理解されている限られた数のゲノム受容部位に統合するための現在の最適なツールです。これらの受容部位は、主に (ただし常にではない)、att B を含むドナーベクターを誘引するという点でファージatt P 部位を模倣しています。現時点で最も有名なメンバーは、ヒトおよびマウスのゲノムのコンテキストで実証済みの可能性を持つ PhiC31-INT です。

上記の Tyr リコンビナーゼとは対照的に、PhiC31-INT は一方向に作用し、ドナーベクターをゲノムに固定されたターゲットにしっかりと固定します。このシステムの明らかな利点は、未改変のネイティブatt P (アクセプター) およびatt B ドナー サイトを利用できることです。マウスおよびヒトのゲノム自体には、限られた数の内因性ターゲット (いわゆる「 att P 疑似サイト」)が含まれているという事実から、さらなる利点 (および特定の複雑さ) が生じる可能性があります。入手可能な情報によると、かなりの DNA 配列要件により、インテグラーゼはレトロウイルスまたはトランスポザーゼベースの統合システムよりも少ないサイトを認識するため、いくつかの確立されたゲノム サイトへの輸送および挿入のための優れたキャリア ビークルとしてのキャリアが開かれ、その一部にはいわゆる「セーフ ハーバー」特性があります。^[10]

特定の（att P x att B）組み換え経路を利用することで、合成された異種特異的attサイトを必要とせずに RMCE が可能になります。しかし、この明らかな利点は、進入する（ドナー）カセットの種類や方向性を制御できないなどの特定の欠点を犠牲にして得られます。^{[6]不可逆性により、「連続 RMCE」反応、つまり特定のゲノム遺伝子}座での繰り返しカセット交換を含む標準的なマルチプレックス RMCEセットアップが許可されないという事実によって、さらなる制限が課せられます。

ヒトとマウスのゲノムの注釈付けにより、受精から胚形成、成体まで生物の発達を導く 20,000 を超えるタンパク質コード遺伝子と 3,000 を超える非コード RNA 遺伝子が特定されました。劇的な進歩が認められる一方で、希少遺伝子変異の関連性は依然として研究の中心的テーマとなっています。

脊椎動物の遺伝子機能を大規模に扱うための最も重要なプラットフォームの 1 つとして、変異マウス ES 細胞のゲノムワイドな遺伝資源が確立されています。この目的のために、マウスゲノムの飽和突然変異誘発を目的とした 4 つの国際プログラムがヨーロッパと北米で設立されました (EUCOMM、KOMP、NorCOMM、TIGM)。国際ノックアウトマウスコンソーシアム (IKSC) によって調整されたこれらの ES 細胞リポジトリは、国際研究ユニット間で交換できます。現在のリソースには、11,539 個の固有遺伝子の変異が含まれており、そのうち 4,414 個は条件付きです。^[14]

関連する技術は現在、他の哺乳類種やヒト幹細胞、特にiPS（人工多能性）細胞への拡張を可能にするレベルに達しています。

• 部位特異的組換え
• リコンビナーゼを介したカセット交換
• Creリコンビナーゼ
• Cre-Lox組み換え
• FLP-FRT組み換え
• 遺伝子組み換え
• 相同組換え

• http://www.knockoutmouse.org/
• Emes, RD; Goodstadt, L; Winter, EE; Ponting, CP (2003). 「ヒトとマウスのゲノムの比較がゲノム動物学の基礎を築く」Hum Mol Genet . 12 (7): 701–9. doi : 10.1093/hmg/ddg078 . PMID  12651866.